Zuivering van hoog molecuulgewicht Genomic DNA van echte meeldauw voor Long-Read Sequencing

Poedermeeldauw een groep obligate biotrofe schimmelplantenpathogenen die, wanneer samengenomen, zijn de belangrijkste oorzaak van plantenziekten wereldwijd ^1. Er zijn meer dan 900 beschreven soorten van echte meeldauw, die taxonomisch zijn gegroepeerd in vijf stammen binnen de familie Erisyphaceae ^2. Als gevolg van zowel het economisch belang en de intieme relatie die zij ontwikkelen met hun gastheren, hebben echte meeldauw ziektes onderwerp van onderzoek voor> 100 jaar. Na infectie, echte meeldauw ontlokken drastische veranderingen in de celstructuur, het metabolisme en moleculaire biologie van hun gastheren, om deze ziekteverwekker ten goede komen. Echter, de studie van echte meeldauw is een bijzondere uitdaging als gevolg van hun obligate lifestyle, en de groei van de schimmel in zuivere cultuur is nog niet beschreven ^{3, 4, 5,}"xref"> ^{6, 7, 8.} Betrouwbare, stabiele genetische transformatie van poederige meeldauw is ook nog niet voltooid hoewel transiënte transformatie gemeld bij sommige soorten ^{9, 10.}

De sequentiebepaling en assemblage van meeldauw genomen is moeilijk gebleken vanwege een aantal kenmerken van het genoom zelf. Echte meeldauw genomen zijn groot (120-180 Mbp) ten opzichte van andere schimmels genomen, en bestaan uit 60-90% gelijkmatig repetitieve elementen ^11. Deze elementen omvatten niet-lange terminale herhalingen, alsook uncategorized repetitieve elementen. Twee formae speciales van een echte meeldauw soorten, Blumeria graminis f. sp. hordei en f. sp. tritici (BGH en Bgt respectievelijk) alsmede de druif echte meeldauw Erysiphe necator, LEVn gesequenced en voorstellen genomen voor verscheidene andere zijn afgerond ^{12, 13, 14.} Het repetitieve aard van de genomen samenstel heeft bemoeilijkt en de voltooide BGH genoom geassembleerd tot 6989 supercontigs een L50 2 Mb ^12.

Ondanks de grote genoom, het poedervormige meeldauw blijken een klein aantal eiwitten coderende genen, met 5.845 en 6.540 genen voorspeld BGH en Bgt resp. De sequentie poederige meeldauw blijken ook ten minste 99 kern genen die essentieel andere schimmels, die in overeenstemming met de afhankelijkheid van de schimmels op de waardplant te overleven ^{11, 12, 13, 14} ontbreekt.

Repetitieve sequenties nabij telomeren, centromeren, ribosomaal RNEen gen arrays en gebieden verrijkt transponeerbare elementen zijn slecht samengesteld uit korte gelezen sequencing strategieën en vaak ondervertegenwoordigd in genoom samenstellen ^15. Dergelijke gebieden worden verondersteld verantwoordelijk voor veel van de spleten die zich in genoomsequenties zijn, en dit geldt voor het poedervormige meeldauw hun omvangrijke uitbreiding van repetitieve elementen ^16. Sterk plastic genoomgebieden worden vaak in dergelijke herhalende gebieden ^3. Ze dienen als een plaats van chromosoomherschikkingen vaak coderen voor genen onder sterk selectieve druk, zoals de genen die coderen effector eiwitten en de genen die coderen voor enzymen van secundair metabolisme. Vooruitgang in single-molecule lange lezen sequencing technologieën een mogelijke oplossing voor het rangschikken in herhaalde gebieden van genomen ^15. B.v. Faino et al. (2015) gevonden dat het opnemen van de lange sequentie gelezen technologieën en optische mapping konden ze een gat-loze genoomsequentie te produceren voor twee stammen van de schimmel plantenpathogeen Verticillium dahlia, verdrievoudigde het percentage herhalende DNA sequenties in het genoom, waardoor het aantal gen annotaties (en vermindering van het aantal partiële of ontbrekende gen annotaties ) en onthullende genoomomleggingen ^17.

Om deze lange-lezen sequencing technologie, hoge concentraties van hoge kwaliteit genoom DNA, in dienst nemen met minimale afmetingen> 20 kbp, nodig zijn. Hier beschrijven we onze methoden voor conidial collectie, zuivering van hoog moleculair gewicht DNA van conidia en onze kwaliteitscontrole assessments met behulp van de echte meeldauw soorten Golovinomyces cichoracearum geteeld op komkommer ^18. Dit protocol is gebaseerd op een protocol ontwikkeld in het laboratorium groep B. Keller (Universiteit van Zürich, Zürich Switzerland) ^{13, 19}en bevat diverse modificaties die leidden tot verhoogde DNA opbrengsten en een groter deel van DNA> 48,5 kbp in grootte. Het protocol bevat ook kwaliteitscontrole stappen basis van aanbevelingen van het Amerikaanse ministerie van Energie Joint Genome Institute ^{20, 21, 22.}

De functie van elk reagens in de lysisbuffer, en de reden voor elke zuiveringsstap, worden beschreven in Henry (2008) ^23. Beschikbare gepubliceerde protocollen voor isolatie van hoogmoleculair genomisch DNA van planten en micro weefsels werden geraadpleegd bij het ontwerpen van dit protocol ^{24, 25, 26, 27, 28.}