使用体外活体细胞成像技术研究脂纳米粒子化疗
Summary
活细胞成像是可视化动态过程的有力工具。对固定细胞的检查只提供静态的图片, 这可能导致对过程的误解和混淆。本文介绍了一种在活细胞中研究脂质体纳米粒子的吸收、释放和细胞内定位的方法。
Abstract
传统的成像技术可以提供有关细胞过程的详细信息。然而, 这些信息是基于静态图像在一个动态系统, 和连续阶段很容易被忽视或误解。活体细胞成像和延时显微镜, 活细胞可以被跟踪几个小时甚至几天, 在一个或多或少连续的时尚, 因此是非常翔实的。本文所述的协议允许对在活细胞中交付阿霉素 (dox) 后化疗纳米微粒的命运进行调查。Dox 是一种插剂, 必须从其 nanocarrier 中释放, 以成为生物活性。尽管其临床注册已有二十多年, 但其摄取、分解和药物释放仍未完全了解。本文探讨的假说, 脂纳米颗粒是由肿瘤细胞, 并逐渐退化。释放的 dox 然后移位到原子核。为了防止固定伪影, 可以应用在实验过程中描述的活细胞成像和延时显微镜。
Introduction
在生命细胞和组织中, 遵循生物过程的能力, 如细胞间相互作用、和细胞内转运、细胞毒复合吸收和蛋白质-蛋白质相互作用, 在过去十年, 因为它提供了额外的维度 “实时”。本文介绍了一种跟踪游离 dox 和 dox 在纳米颗粒 (dox-NP) 中的胞内命运的方法。
几十年来, 纳米粒子被用于治疗某些癌症。Dox-NP 已经批准治疗艾滋病相关的卡波西肉瘤, 晚期卵巢癌和乳腺癌, 多发性骨髓瘤1。它是第一个在临床环境中开发和引入的脂质体纳米颗粒之一。自由形式, dox, 是从血液循环中大大清除, 限制其能力, 以足够的数量到达肿瘤网站。此外, 治疗伴随着严重的和剂量限制的副作用, 如口腔炎和心力衰竭。当封装成乙二醇脂质体纳米颗粒的循环时间从分钟增加到几天2。这种类型的胆固醇脂质体是相当稳定, 这种稳定性决定了药代动力学的封装药物。
然而, 这种刚性有一个缺点。一个化合物对肿瘤细胞的细胞毒能力首先被评估在体外, 它已经表明, dox 是更有效的比 dox NP 在细胞毒化验3,4。假设载体的稳定性阻止了药物的释放和细胞的摄取, 值得进一步研究这种现象。固有的脂质体属性, 建立到最后的侵略性元素的血液流和达到完整的肿瘤部位, 导致损害生物利用度的细胞毒性成分 (即, dox) 在目标站点 (即,肿瘤细胞核)。虽然 Dox-NP hardily 改善了响应与自由形式相比, 它仍然是临床价值, 因为封装显著减少了心脏效果5。在随后的几年中, 其他化合物被封装在纳米载体中6。另外, 修改载体导致了触发药物释放 (即,在肿瘤部位), 但维持血液循环的稳定性7,8。尽管多年的调查和临床使用, 纳米的肿瘤的命运, 如 Dox NP 仍然不完全清楚。在最近的一份出版物中, 人们发现纳米粒子被作为一个整体被占了, 而 dox 仍然被困在溶酶体9中。
细胞摄取纳米微粒和药物释放是动态过程, 可以最好地使用活细胞成像监测。此外, 传统的组织学, 其中细胞孵育, 然后固定, 可以给假结果, 如果固定破坏脂质体载体和引进文物。对活细胞成像的主要要求是可视化, 最好是通过荧光, 所需的过程。某些化合物, 如 dox, 有一个固有的红色荧光。此外, 荧光标记可以引入到载体, 和细胞器可以可视化使用活细胞标记。这样, 就可以对载体的摄取、药物释放和细胞定位等一系列参数进行成像和分析。在这一方法中, dox 和 dox 在几个肿瘤细胞中的细胞间的命运在 real-time。此外, 这种方法可以很容易地适应创造理想的条件为目标 (例如,带电纳米粒子10) 和触发 (如,热疗7) 药物释放。
Protocol
Representative Results
Discussion
正如以往观察到的, 固定可以破坏脂质体纳米几乎立即和 DXR 释放形式这些被破坏的脂类还有时间进入细胞核, 使解释数据非常困难, 甚至误导。通过一些细微的调整, 可以对活细胞和组织中的化疗命运进行例行调查, 以确认或推翻组织学观察。最近的一篇论文显示了 DXR 的摄取, 释放和定位的细胞在自由和封装 dox 使用活细胞延时成像9。这项工作更详细地描述了实验设置。使用这个模型, 可以直观地将 dox 的直接传输到细胞核, 在那里它不断累积直到细胞最终死亡。相反, 当使用 Dox 时, 只有少量的释放的 Dox 在原子核中被发现。虽然连续的曝光结果在连续的 DXR 积累, 荧光信号是低得多的 Dox-NP-与 Dox 处理的细胞, 表明在细胞浓度和随后细胞毒性的差异。此外, 通过使用活细胞标记, 它表明, 当暴露细胞到 Dox-NP, DXR 和 nanocarrier 位于溶。这表明, 完整的脂质体是由细胞, 并表明参与的吞通路在吸收这些纳米颗粒。原子核中的 DXR 显然是从 dox 释放出来的。然而, 使用这种方法, 无论是 DXR 和载体 co-localize, 似乎是在溶酶体, 它仍然是不确定是否封装或释放 dox。纳米粒子的内在稳定性可能在溶的局部化时防止 dox 释放。
在这个协议中, 活细胞成像是使用一个具体的显微镜设置, 与一个 custom-made 阶段持有人 (规格可以根据要求提供)。然而, 大多数共焦显微镜制造提供了一系列的孵化器, 执行活细胞成像。保留细胞培养条件 (即,温度, CO2, pH 值, 湿度和不育) 是这些孵化器的主要标准, 需要进行一些初步测试以确定适当的条件, 这是进一步的解释。自动化的数据采集程序也可以由相同的制造商提供。”多位置” 选项使在同一腔室中有多个位置的图像成为可能, 从而细化统计分析。但是, 这个在这个手稿中提到的宏的选择需要固定的 XYZ 位置, 其中的可能性, 纠正 Z 漂移丢失。扫描 Z 维度可以包含在此宏中, 并使用焦点平面进行分析。然而, 这需要额外的扫描, 增加了光和漂白的可能性。
与所有的荧光测量一样, 过度曝光是一个问题, 特别是当比较两个化合物与不同的细胞摄取量。荧光强度不仅依赖于化合物的固有信号, 而且还取决于吸收率、浓度和药物暴露时间。如图3所示, dox 处理过的细胞的核 DXR 含量已经可见, 而在 dox-NP 处理的细胞中没有发现信号。只有增加增益才能使 Dox-NP 处理细胞的 DXR 可视化, 导致 Dox 处理细胞过度暴露。此外, 即使细胞, Dox-NP 异分布, 这可能导致不可避免的或过度曝光。特别是在研究细胞 DXR 诱捕时, 增益明显降低, 以区分个体化器 (图 5B和5C)。因此, 以像素密度表示的测量必须伴随有代表性的图像, 以便正确解释结果。
光、漂白和低信噪比也是荧光显微镜中的重要问题, 必须建立图像质量与图像采集之间的折衷关系。然而, 即使在显微镜设置是最佳的, 图像质量也很大程度上取决于质量的细胞和增加的化合物。DXR 提供了一个强烈的信号, 并采取适当的预防措施, 漂白是没有观察到, 即使在较长的时期 (高达72小时)。然而, 荧光信号的减少也可能是外排的结果。外排是一个重要的现象, 在耐药性15和发生时, 细胞泵出药物从细胞内的行动场所。因此, 随着时间的推移, 荧光信号的减少也可能是 dox 射流9的结果。将实验结束时的 non-scanned 位置的荧光信号与延时序列中的最后一个图像进行比较, 将显示漂白 (即,信号在 non-scanned 位置更高) 或流出 (即信号将是相同的)。一些矫正选项 (例如,背景, 漂移, 漂白,等) 可在 ImageJ16等程序中使用。此外, 随着时间的推移, 荧光强度的增加, 配置设置可以 pre-evaluated 在一个试点试验, 以尽量减少过度暴露在结束时的延时 (步骤 3.21)。另外, 一个成像室与细胞已经暴露在药物为所需的期限可以用来初始化设置。最后, 对于这种类型的分析, 有毒药物浓度 (步骤 3.22) 应避免和预先设定使用传统的生物化验。
细胞在不含酚红的培养基中连续培养和维持。酚红荧光在红色部分的频谱, 可以观察到细胞器, 最有可能的溶酶体, 呈现假阳性信息 (步骤 1.2)。为了允许对单个细胞进行监测, 细胞融合不应超过 70% (步骤 3.1)。CO2流速 (步骤 3.5) 需要在设备购买或维修后的验证试验中进行调整。当速度太高时, 介质会蒸发。当速度过低时, 培养基的 pH 值会增加, 这会影响细胞的生长。由于培养基是没有酚红色 ph 值指标的变化不能被观察到, 因此很容易被忽视。在验证 CO2流后, 这些设置可用于所有未来的实验。
使用这里描述的方法, 纳米粒子的命运可以很容易地用活细胞成像和延时显微镜来研究。在这个过程中, 使用了商业上可用的纳米粒子。然而, 热敏性的命运17, 阳离子脂质体10;脂质体富含链 shingolipids18;和纳米粒子封装其他药物8,19也以这种方式在肿瘤和正常细胞中进行了调查。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
使用的显微镜设施是伊兹斯光学成像中心的一部分, 我们要感谢伊斯兰会议组织工作人员的服务。
Materials
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter – 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
References
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