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Immunology and Infection

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em>インビトロ</em>ヒト血液脳関門のモデル

Published: April 05, 2017
doi:
10.3791/55390
, , , , ,
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology,University Hospital Münster

Summary

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Abstract

中枢神経系（CNS）へのリンパ球の血管外漏出は、免疫監視のために重要です。リンパ球の血管外漏出の疾患関連変異は、CNSにおける病態生理学的変化をもたらす可能性があります。このように、CNSへのリンパ球遊走の調査は、炎症性CNS疾患を理解するために、新たな治療アプローチを開発することが重要です。ここでは、リンパ球の血管外漏出を研究するために、ヒトの血液脳関門のin vitroモデルを提示します。ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC）がコンフルエント血液脳関門の内皮を模倣するように挿入TRANSWELL多孔性ポリエチレンテレフタレート上に成長させます。バリア機能は、閉鎖帯occludens免疫組織化学、経内皮電気抵抗（TEER）の測定ならびにエバンスブルー透過の分析によって確認されます。 NK細胞–このモデルは、CD56 明るい CD16 dimに/ような稀なリンパ球サブセットの漏出の調査を可能にします。 Furtherm鉱石、他の細胞、サイトカインおよびケモカイン、疾患関連の変化、およびリンパ球の遊走能に異なる治療計画の効果を研究することができます。最後に、内皮バリアに炎症性刺激の影響だけでなく、異なる治療計画を解析することができます。

Introduction

組織への血液からリンパ球遊走は免疫監視のために重要です。特定の分子間相互作用の順序は、小腸、皮膚、リンパ節、中枢神経系（CNS）、および他の組織1内に部位特異的血管外遊出を確実にします。リンパ球遊走における変化は広い拡散疾患2の数の病態生理に関与しています。免疫特権CNSへの移行は厳密に調節され、それに応じて、このプロセスの変化は脳脊髄炎3、視神経脊髄炎、脳卒中、及び多発性硬化症（MS）2、4、5、6、7のようなCNS関連疾患に関与しています。したがって、より良い病気の病態生理を理解し、のためのツールを開発するために、リンパ球の血管外漏出を研究することが重要です疾病負担8、9、10、11、12の干拓。

リンパ球は、異なる経路を介してCNSに移動します。脈絡叢内の血液-脳脊髄液関門を介して、及び血液脳関門を通過くも膜下空間に後毛細血管細静脈を通って溢出1に記載されている、13、14、15。血液脳関門を横切って移動は、内皮細胞14とリンパ球との相互作用によって行われます。周囲の内皮細胞とは対照的に、CNSの内皮細胞は、それによって厳密に血液脳関門を通過することが可能な細胞およびタンパク質の量を制限する、タイトジャンクション分子を大量に発現します小娘= "外部参照"> 16。タイトジャンクションの緩みにおける炎症の結果および接着分子の発現を誘導します。従って、CNS 1、17、18へのリンパ球の遊走を増強します。

血液脳関門を介した血管外漏出は、多段階プロセスです。内皮細胞へのテザーを、リンパ球、次いで主セレクチン1、15により媒介されるプロセスにおける内皮に沿って転がります。その後、リンパ球上に発現内皮によって分泌ケモカインそれぞれケモカイン受容体との間の相互作用は、それによって内皮細胞1に強固な接着を促進し、インテグリンの立体構造変化を誘導します。最後に、血管周囲の空間にtransmigrating前に、血流に対する内皮バリアに沿っていずれかのクロールをリンパ球、または直ちに直接transmストール強固な接着1、19、20のサイトでigrate。リンパ球の血管外漏出のすべての手順は、異なる技術21を用いてインビトロで分析することができます。タイムラプスビデオ顕微鏡は、初期テザリングとローリング15を研究するために使用されます。接着アッセイは、障壁22を内皮細胞へしっかり逮捕に関する詳細な情報を提供します。ここで実証されるように遊出アッセイは、免疫細胞の遊出21、23、24、25、26、27、28、29の分析を可能にします。

体外血液脳関門モデルに人間を使用して、我々は最近、高いMIGRことを示すことができましたCD56 明るい CD16 dimに/のatory容量–そのCD56 ディム CD16 +対応物と比較して、NK細胞は、クモ膜下区画21において、このNK細胞サブセットの優位性により反映されました。したがって、我々の実験は、in vivoでの状況を模倣するのに適しのようです。

Protocol

ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC）1.細胞培養細胞培養フラスコのコーティングフィブロネクチン溶液を調製し、15 mL遠心管に10mLのPBSを加えます。 150μLのフィブロネクチンを加え、よく混ぜます。 底部を覆うようにT-25細胞培養フラスコは、フィブロネクチン溶液2mLを加えます。インキュベーター中で37℃で少なくとも3時間、細胞培養フラスコをインキュベートします。フィ…

Representative Results

ヒト血液脳関門モデル（ 図1A）を使用して、NK細胞およびT細胞サブセットの遊出を示す代表的な結果が示されています。 HBMEC単層の完全性は、タイトジャンクション分子ZO-1、経内皮電気抵抗（TEER）の測定、及びエバンスブルー透過（ 図1B）の染色によって確認しました。 3次- 4日間培養HBMECは、タイトジャンクション分子ZO-1（左図1Bを<…

Discussion

ここでは、ヒトの血液脳関門を通過するリンパ球の遊出を調査する手法を提示します。 CNSへのリンパ球遊走のin vitroでの解析では 、リンパ球の血管外漏出、潜在的な疾患関連の変更、および新しい治療アプローチの基本的なプロセスを研究することが重要です。

血液脳関門モデルのいくつかの変更が可能です。例えば、上部区画からの細胞を非遊走細胞集?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

Materials

PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11
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References

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Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).
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