تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em> في المختبر</em> نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز
Summary
Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.
Abstract
لمفاوية تسرب في النظام العصبي المركزي (CNS) أمر بالغ الأهمية لمراقبة المناعية. التعديلات المتعلقة مرض تسرب الخلايا اللمفاوية قد يؤدي إلى تغيرات الفيزيولوجية المرضية في الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، والتحقيق في هجرة الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي مهم لفهم الأمراض CNS التهابات وتطوير طرق العلاج الجديدة. هنا نقدم نموذجا في المختبر من حاجز الدم في الدماغ البشري لدراسة الخلايا اللمفاوية التسرب. تزرع الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري الخلايا البطانية (HBMEC) confluently على البولي ايثلين مسامية transwell إدراج لتقليد البطانة من حاجز الدم في الدماغ. التحقق من صحة ظيفة الحاجز من قبل نطيقة النطيقة المناعية، والمقاومة الكهربائية transendothelial (طير) القياسات وكذلك تحليل إيفانز تخلل الأزرق. هذا النموذج يسمح التحقيق في انسلال من مجموعات فرعية لمفاوية نادرة مثل CD56 CD16 مشرق قاتمة / – خلايا NK. Furthermخام، وآثار الخلايا الأخرى، السيتوكينات و chemokines، التعديلات المتعلقة بالمرض، ونظم العلاج واضحة على قدرة المهاجرة من الخلايا الليمفاوية يمكن دراستها. وأخيرا، فإن تأثير محفزات للالتهابات وكذلك نظم العلاج المختلفة على حاجز غشائي يمكن تحليلها.
Introduction
اللمفاويات الهجرة من الدم إلى الأنسجة أمر بالغ الأهمية لمراقبة المناعية. A سلسلة من التفاعلات الجزيئية محددة يضمن موقع التسرب معين في الأمعاء الدقيقة، والجلد والغدد الليمفاوية، والجهاز العصبي المركزي (CNS)، وغيرها من الأنسجة 1. وتشارك التعديلات في الهجرة لمفاوية في الفيزيولوجيا المرضية لعدد من الأمراض واسعة الانتشار 2. الهجرة إلى الجهاز العصبي المركزي المناعة متميز ينظم بإحكام وفقا لذلك تشارك التعديلات لهذه العملية في الأمراض المتصلة الجهاز العصبي المركزي مثل التهاب الدماغ والنخاع 3، البصري التهاب النخاع و الأعصاب، والسكتة الدماغية، والتصلب المتعدد (MS) 2، 4، 5، 6، 7. وبالتالي، فمن المهم دراسة لمفاوية تسرب إلى فهم أفضل الفيزيولوجيا المرضية المرض وتطوير أدوات ل تحسين الاراضي من عبء المرض 8، 9، 10، 11، 12.
الخلايا الليمفاوية تهاجر إلى الجهاز العصبي المركزي عبر طرق مختلفة. وقد وصفت التسرب من خلال الأوردة للشعيرات في الفضاء تحت العنكبوتية عبر حاجز السوائل الدم النخاعي داخل الضفيرة المشيمية وعبر حاجز الدم في الدماغ 1 و 13 و 14 و 15. تتم الهجرة عبر حاجز الدم في الدماغ عن طريق التفاعل بين الخلايا الليمفاوية مع الخلايا البطانية 14. وعلى النقيض من الخلايا البطانية في محيط الخلايا البطانية من CNS تعبر عن كميات عالية من جزيئات تقاطع ضيقة، مما يحد بدقة كمية من الخلايا والبروتينات قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغمعشوقة = "XREF"> 16. النتائج التهاب في تخفيف منعطفات ضيقة ويستحث التعبير عن جزيئات الالتصاق. وبالتالي، تعزيز الهجرة لمفاوية في الجهاز العصبي المركزي 1 و 17 و 18.
تسرب عبر حاجز الدم في الدماغ هو عملية متعددة الخطوات. الخلايا اللمفية الحبل على الخلايا البطانية ثم لفة طول البطانة في عملية بوساطة أساسا selectins 1، 15. وفي وقت لاحق، والتفاعلات بين كيموكينات التي يفرزها البطانة والمستقبلات chemokine منهما أعرب عن الخلايا الليمفاوية تحدث تغييرات بتكوين لintegrins، وبالتالي تعزيز التصاق الثابت الخلايا البطانية 1. وأخيرا، الخلايا اللمفية إما الزحف على طول حاجز غشائي ضد تدفق الدم قبل transmigrating في الفضاء المحيط بالأوعية، أو المماطلة فورا ومباشرة نقل الحركةigrate في موقع شركة التصاق 1 و 19 و 20. ويمكن تحليل كل هذه الخطوات من تسرب الخلايا اللمفاوية في المختبر باستخدام تقنيات متميزة 21. ويستخدم الوقت الفاصل بين الفيديو المجهر لدراسة الربط الأولي والمتداول 15. توفر فحوصات التصاق معلومات مفصلة حول اعتقال الراسخ البطانية الحواجز 22. فحوصات التهجير كما هو موضح هنا تسمح بتحليل خلايا المناعة التهجير 21، 23، 24، 25، 26، 27، 28، 29.
باستخدام البشرية في الدم في المختبر نموذج حاجز الدماغ، ونحن يمكن أن تظهر في الآونة الأخيرة أن migr العاليالقدرة atory من CD56 CD16 مشرق قاتمة / – خلايا NK مقارنة CD56 خافت انعكس CD16 + نظرائهم من غلبة هذا فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية في حجرة داخل القراب 21. وبالتالي، فإن الإعداد التجريبية يبدو أن تكون مناسبة لمحاكاة الوضع في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم تقنية للتحقيق في التهجير من الخلايا الليمفاوية عبر حاجز الدم في الدماغ البشري. في تحليل المختبر الهجرة اللمفاويات إلى الجهاز العصبي المركزي هو مهم لدراسة العمليات الأساسية للتسرب الخلايا اللمفاوية، والتعديلات المحتملة المتعلقة بالمرض، وطرق علا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).
Materials
| PBS | Gibco | 14190-094 | without CaCl2 or MgCl2 |
| Fibronectin 1mg/mL | Sigma | F1141-5MG | from bovine plasma |
| T-25 cell culture flask | Greiner BioOne | 690160 | |
| HBMEC | ScienCell | 1000 | |
| Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
| ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
| FBS | ScienCell | 1001-b | |
| Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 1001-b | |
| Endothelial cell growth supplement | ScienCell | 1001-b | |
| Transwell | Corning | 3472 | clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size |
| 96-well flat bottom plate | Corning | 3596 | |
| Evans blue | Sigma | E2129-10G | stock solution: 1 g/50 mL PBS |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrated |
| Infinite M200Pro | Tecan | ||
| 96-well black flat bottom plate | Greiner BioOne | 675086 | |
| 48-well plate | Corning | 3526 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Flow Count Fluorospheres | Beckman Coulter | 7547053 | |
| Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Gallios 10-color flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
| TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
| CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
| CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
| CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
| CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
| CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |
References
- Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
- Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
- Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
- Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
- Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
- Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
- Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
- Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
- Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
- Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
- Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
- Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
- Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
- Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
- Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
- Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
- Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
- Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
- Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
- Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
- Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
- Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
- Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
- Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
- Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
- Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
- Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
- Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
- Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
- Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
- Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
- Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
- Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
- Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
- Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
- Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
- Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).
