Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri
Summary
Fonksiyonel ve fenotipik analizi için antijene reaktif B hücreleri tespit etmek ve ettirecek bir manyetik nano-tanecikleri kullanır basit ama etkili bir yöntem tarif edilmiştir.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
Sınırlandırıcı sulandırma antikor salgılayan hücre ön-madde frekans analizleri, belirli bir antijene reaktif B hücreleri tipik olarak aşı statüsü ve antijen üzerinde mevcut olan epitopları boyutu / sayısına bağlı olarak, normal bir repertuar% 0.05 0.005 arasında bir sıklıkta gerçekleştirilir olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu hücrelerin düşük frekanslı zor bir yabancı antijene karşı, veya otoimmün orijinli bir hastalık sırasında aşağıdaki aşılama veya maruz kalma gibi bağışıklık tepkilerinin, gelişimi sırasında durumundaki değişiklikleri çalışma yapmıştır. Daha önce, araştırmacılar, antijen kaplı kırmızı kan hücresi sıfırlama antijen kaplı plakalar veya sütun adsorbanlar arasında değişen teknikler kullanılarak antijene reaktif B hücrelerinin izole üstlenmiştir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ayırma hücresi floresans ile aktive. thougBu teknikler antijene reaktif B hücreleri belirlenmesi ve izole başarılı olmuştur h sonuçlar verim, saflık ve ölçeklenebilirlik açısından değişmiştir. Son zamanlarda biz de algılamak ve manyetik nanopartiküller kullanarak nadir B lenfosit alt popülasyonlar zenginleştirmek için yeni bir yöntem geliştirdi. yöntem, geniş bir başlangıç popülasyonlarından nispeten yüksek verim ve saflıkta zenginleştirme sağlar ve antijene yanıtların analizi ile uyumludur. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin popülasyonlardan zenginleştirerek metot, antijene kaplı levha veya gruplarından ve limit hacmi geometrisi ile ilişkili kısıtlamalar ortadan kaldırır. zenginleştirilmiş hücrelerin antijen ve bir flüoresan raportör ile birlikte devam Son olarak, çünkü, bunlar daha FACS sıralama ile saflaştırılabilir. Burada tarif edildiği gibi çeşitli autoi olan deneklerden daha önce periferal kan tetanos toksoid-reaktif B hücrelerinin çalışma ve insan deneklerin aşağıdaki aşılama yaklaşımı, hem de otoantijen-reaktif B hücreleri kullandıkTip 1 diyabetin, Graves hastalığı, ve Hashimoto hastalığı 7 de dahil olmak üzere mmune bozuklukları. yöntem, fare ve insan eşit derecede iyi çalışır ve çeşitli dokularda (hazırlama yazısı) antigen reaktif B hücrelerinin analizi ile uyumludur.
Temel biçiminde, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ilk fenotipik analizi için gerekli olan hücre yüzey antijenlerine karşı antikorlar ile biyotinile edilmiş antijen ile inkübe edilir. Bu etiketleme adım yıkama ve tespit ve hücreleri biyotinlenmiş-antijeni (Şekil 1) tespiti için uzak-kırmızı-floresan boya bağlanmış streptavidin ilave edildi edilir. Daha önceki çalışmalar, benzer bir şekilde antijene spesifik B hücreleri tespit ettik ancak burada antijenler doğrudan florokrom 8, 9, 10, 11 konjüge. bu layık olmasına rağmenyaklaşım streptavidin ile bağlantılı olarak biyotinlenmiş antijenler kullanımı antijenleri, 12, 13, 14 küçük, özellikle daha büyük bir sinyal amplifikasyon (bağlanma ve bağlayıcı hücrelerin dolayısıyla daha iyi farklılaşma) sağlar. Ek göz streptavidin yerine avidin, streptavidin deglikosile olduğundan, spesifik olmayan bağlanma azaltılması kullanılmasıdır. Ayrıca, biz nedeniyle, kuantum verimi (parlaklık) kendi foto stabilitesi ve küçük boyutu (~ 1.3 kD) için florokrom kadar kırmızı-floresan boya kullanın. Potansiyel olarak bir çok antijenik epitopları içerdikleri için protein, fikoeritrin olarak fluorochromes (~ 250 kD) ve alofikosiyanin (~ 105 kD) 15 optimal değildir. Bu uzak-kırmızı-flüoresan boya olarak, tek bir epitop oluşan küçük organik bir floresan boya kullanılması, izole edilmiş hücre popülasyonunun karmaşıklığını azaltır.
Hücreler sonra biyotinile-antigen ve uzak-kırmızı-floresan boya-streptavidin adsorbe, anti-uzak-kırmızı-floresan boya-konjuge manyetik nanopartiküller kullanılarak zenginleştirilmiştir. Tek nanopartiküller malzeme akışı sitometre ile tespit edilmez ve bu nedenle ayırma FACS ve alt deneyleri 16 ile saflaştırma öncesinde iyice uzaklaştırılması gerekmez. antijen-spesifik B hücreleri için manyetik seçim zamanı ve debi sitometresinde nadir olaylar sıralama maliyetini ortadan kaldırarak, ilgi nüfusu zenginleştirir.
Daha önce, yedi gün tetanos toksoid destekleyici aşılamadan sonra gönüllüden tetanoz toksoid özgü B hücrelerinin çoğalmasını, temsili sonuçlar göstermektedir görebilirsiniz. In vivo uyarım akut Aşağıdaki antijene özgü B hücreleri zenginleştirmek için bu yöntemin yeteneğini göstermek için, örnek olarak, bu özel uygulama seçtik. akış sitometrisi ile birlikte, bu yöntem, zenginleştirici ve ayırt antijene özgü saf, bellek kapasitesine sahip olan veplazmablast B hücreleri ve araştırmacı zamanla sıklığı değişiklikleri izlemenizi sağlar. Buna ek olarak, örneğin, hücreler, zenginleştirme Aşağıdaki antikor salgılayan kabiliyetini muhafaza göstermektedir bir ELISPOT deneyi, başka bir olası alt-deneyi içerir. Bu yöntemin başka bir uygulaması, bir konakçıya zenginleştirilmiş hücrelerinin adoptif transferini içerebilir. Daha önce hücreler izolasyon ve devri sonrasında antijen-spesifik T hücrelerine antijen sunan hücrelerin olarak hareket yeteneğini korumak göstermiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, araya antijene özel bağışıklık tepkisinin anlaşılmasını bilgi yöntemi, bağlanmış olabilir aşağı taraftaki muhtemel bir çok deney mevcuttur. Biz genel verim, saflık, hücre özgünlüğünü belirleyen ve kat-zenginleştirme kontrolleri de dahil olmak üzere, yöntem aşağıda tarif var.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada yalıtım ve insan periferal kanından antijen bağlayıcı B hücrelerinin çoğalmasını, gerçekleştirmek için yeni bir metot açıklamaktadır. yöntem, farelere ve dalak ve lenf düğümleri gibi diğer dokuların, kolaylıkla uygulanabilir ve hücre fenotipi ve fonksiyonu (hazırlama yazısı) sonrası zenginleştirme analizi ile uyumludur.
Kullanıcı, bu işlemin başarılı olmasını etkileyebilecek değişkenlerin bir dizi vakıf olmalıdır. deneyim ölü hücreler non-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
