Обнаружение и обогащение редких антиген-специфических B Клетки для анализа фенотипа и функции
Summary
Простой, но эффективный метод, который использует магнитные наночастицы для обнаружения и обогащения антиген-реактивных В-клеток для функционального и фенотипического анализа описан.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
Лимитирующего разведения анализ частоты предшественника клеток секретирующих антитела показали, что В-клетки, реакционноспособные в отношении конкретного антигена, обычно возникают на частоте от 0,05 до 0,005% в обычном репертуаром, в зависимости от статуса вакцинации и размер / количество эпитопов, присутствующих на антиген. Низкая частота этих клеток затрудняет для изучения изменений в их статусе в процессе развития иммунных реакций, таких как после вакцинации или воздействие чужеродного антигена, или во время развития аутоиммунитета. Ранее исследователи провели изоляцию антиген-реактивных В – клеток с использованием методик , начиная с антигенным покрытием пластин или адсорбенты колонки, к покрытым антигеном клеток сбросу красной крови, флуоресценцией сортировка клеток 1, 2, 3, 4, 5, 6. Thougч эти методы были успешными в деле выявления и выделения антиген-реактивных В-клеток, результаты варьировались с точки зрения доходности, чистоты и масштабируемости. Недавно мы разработали новый метод, как обнаружить и обогащать редкие B субпопуляций лимфоцитов с использованием магнитных наночастиц. Метод позволяет обогащение с относительно высоким выходом и чистотой из крупных исходных популяций, и совместим с анализом ответов на антиген. Обогатив из популяций клеток в суспензии, метод устраняет ограничения, связанные с геометрией пластинок, покрытых антигеном или столбцов, а также ограничить пропускную способность. И наконец, так как обогащенные клетки остаются связанными с антигеном и флуоресцентным репортером, они могут быть дополнительно очищен с помощью FACS-сортировкой. Как описано в настоящем документе, мы использовали этот подход для исследования периферической крови столбнячный анатоксин-реактивным В-клеток до и после иммунизации человеческих субъектов, а также аутоантигенов-реактивный В-клетки пациентов с различными autoimmune расстройства, в том числе сахарный диабет 1 типа, базедова болезнь, и болезнь Хашимото 7. Метод одинаково хорошо работает в мыши и человека, а также совместим с анализом антиген-реактивных В-клеток из различных тканей (рукопись в процессе подготовки).
В своем базовом формате одноядерные клетки периферической крови инкубируют с биотинилированным антигеном вместе с антителами к антигенам клеточной поверхности, необходимые для фенотипического анализа. Этот этап маркировки с последующей промывкой и фиксации, а также добавлением стрептавидина , соединенный с дальним красным-флуоресцентный краситель для обнаружения биотинилированного-связывания антигена клеток (рисунок 1). Предыдущие исследования выявили антиген-специфических В – клеток аналогичным образом , но при использовании антигенов , непосредственно конъюгированное с флюорохромом 8, 9, 10, 11. Несмотря на то, что это достойноподход, использование биотинилированных антигенов в сочетании с стрептавидином дает большее усиление сигнала (следовательно , более четко разграничить связывания и необязательных клеток), в частности , когда антигены малы 12, 13, 14. Дополнительным фактором является использование стрептавидина вместо авидин, так как стрептавидин дегликозилирован, уменьшая неспецифическое связывание. Кроме того, мы используем далеко-красно-флуоресцентный краситель в качестве флуорохрома из-за его светостойкости, квантовый выход (яркость) и его небольшой размер (~ 1,3 кД). Белковые флуорохромы , такие как фикоэритрин (~ 250 кДа) и аллофикоцианин (~ 105 кДа) 15 не являются оптимальными , поскольку они потенциально содержат много антигенные эпитопы. Использование небольшого органического флуоресцентного красителя, состоящего из одного эпитопа, например, дальнего красного флуоресцентного красителя, уменьшает сложность населения изолированной клетки.
После того, как клетки биотинилированного-аntigen и далеко-красно-флуоресцентный краситель адсорбированная-стрептавидин, они обогащены с использованием анти-далеко-красно-флуоресцентный краситель-конъюгированные магнитные наночастицы. Одиночные наночастицы не обнаруживаются большинством цитометров и , следовательно , не должны быть удалены до очистки с помощью FACS сортировки и последующих анализов 16. Магнитный отбор антиген-специфичных В-клеток обогащает население интерес, устраняя затраты времени и средств сортировки редких событий с использованием проточного цитометра.
Ниже мы покажем, репрезентативные результаты от обогащения столбняк-анатоксина специфических В-клеток от субъекта до и через семь дней после столбняка повторной иммунизации. Мы выбрали это конкретное применение в качестве примера для того , чтобы продемонстрировать способность этого метода обогащать антиген-специфические В – клетки после острой стимуляции в естественных условиях. В сочетании с проточной цитометрии, этот метод способен обогащать и дифференцирующей антиген-специфической наивным, памяти, иplasmablast В-клетки и позволяет исследователю следить за изменениями в их частоте с течением времени. Кроме того, мы включаем другой возможный вниз по течению анализа, например, анализа ELISPOT, который демонстрирует , что клетки сохраняют способность секретировать антитела следующего обогащения. Другое применение этого метода может включать в себя адоптивную передачу обогащенных клеток в организм хозяина. Ранее мы показали, клетки сохраняют способность действовать в качестве антиген-представляющих клеток на антиген-специфических Т-клеток после выделения и передачи информации (данные не показаны). Следовательно, существует целый ряд возможных последующих анализов, которые могут быть связаны с методом, который вместе информирующее понимание антиген-специфического иммунного ответа. Мы описали метод ниже, включая элементы управления, чтобы определить общий выход, чистота, клеточную специфичность и откидные обогащения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем метод для достижения выделения и обогащения антигенсвязывающих В-клеток из периферической крови человека. Метод легко применимы к мышам и в других тканях, таких как селезенка и лимфатические узлы, а также совместим с пост-обогатительной анализа клеточного фенотипа и ф?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
