איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד
Summary
שיטה פשוטה אך יעילה המעסיקה חלקיקים מגנטיים כדי לזהות ולהעשיר תאי B-reactive אנטיגן לניתוח פונקציונלי פנוטיפי מתואר.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
הגבלת דילול המנתח של תדר מבשר תאי מפרישי נוגדן הציע B תאים תגובתי אנטיגן מסוים מתרחשים בדרך כלל בתדר של 0.05 ל 0.005% ברפרטואר הרגיל, בהתאם למצב החיסון והגודל / מספר אפיטופים הנוכחי על אנטיגן. התדירות הנמוכה של תאים אלה מקשה ללמוד שינויים במעמדם במהלך פיתוח של מערכת חיסונית, כגון החיסון הבא או חשיפת אנטיגן זר, או במהלך ההתפתחות של אוטואימוניות. בעבר, חוקרים התחייבו בידוד של תאי B-reactive אנטיגן באמצעות טכניקות החל צלחות או adsorbents טור מצופה אנטיגן, כדי איפוס תאי דם אדום מצופה אנטיגן, קרינה המופעל מיון תא 1, 2, 3, 4, 5, 6. though טכניקות אלו היו מוצלחות בזיהוי ובידוד תאי B תגובתי-אנטיגן, התוצאות השתנו במונחי תשואה, טוהר ויכולת רחב. לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה לשני לזהות ולהעשיר תת-אוכלוסיות לימפוציטים B נדירים באמצעות חלקיקים מגנטיים. השיטה מאפשרת העשרה עם תשואה גבוהה יחסית וטוהר מאוכלוסיות מוצא גדולים, והוא תואם עם ניתוח של תגובות אנטיגן. על ידי העשרה מאוכלוסיות של תאים בתרחיף, השיטה מבטלת אילוצים הקשורים בגיאומטריה של צלחות מצופות אנטיגן או עמודות, ותפוקת גבול. לבסוף, מאז תאים מועשרים נשארים הקשורים אנטיגן כתב ניאון, הם יכולים להיות מטוהרים עוד יותר על ידי מיון FACS. כפי שתואר במסמך זה השתמשנו גישה זו ללימוד של תאי B toxoid-reactive טטנוס הדם ההיקפיים לפני וחיסון הבאים בבני אדם, כמו גם תאי B autoantigen-reactive מן הנבדקים עם autoi שוניםפרעות mmune, כולל סוכרת מסוג 1, מחלת גרייבס, ומחלת השימוטו 7. השיטה עובדת באותה מידה אדם לעכבר, והוא תואם עם ניתוח של תאי B-reactive אנטיגן ממגוון רקמות (כתב היד בהכנה).
בשנת הפורמט הבסיסי שלה, תאי דם היקפיים mononuclear מודגרת הראשון עם אנטיגן biotinylated יחד עם נוגדנים לתא אנטיגנים השטח הנדרש לניתוח פנוטיפי. צעד תיוג זה ואחריו כביסה קיבעון, והוספת streptavidin מצמידים את צבע מרחיקות אדום ניאון לגילוי של אנטיגן biotinylated מחייב תאים (איור 1). מחקרים קודמים זיהו תאי B אנטיגן ספציפי באופן דומה אך אנטיגנים באמצעות מצומדות ישירות fluorochrome 8, 9, 10, 11. למרות זאת הוא ראויגישה, שימוש אנטיגנים biotinylated בשיתוף עם streptavidin מאפשרת הגברת אות יותר (ומכאן בידול טוב יותר של כריכה, תאים בלתי מחייבים), במיוחד כאשר אנטיגנים הם קטנים 12, 13, 14. שיקול נוסף הוא השימוש streptavidin במקום avidin כי streptavidin הוא deglycosylated, ומקטין את הלא ספציפית מחייב. יתר על כן, אנו משתמשים צבען מרחיקות אדום ניאון כמו fluorochrome בשל photostability שלה, תשואה קוונטית (בהירות), ואת גודלו הקטן (~ 1.3 KD). Fluorochromes חלבון כגון Phycoerythrin (~ 250 KD) ו allophycocyanin (~ 105 KD) 15 אינם אופטימליים כי הם פוטנציאל להכיל אפיטופים אנטיגני רבים. שימוש פלורסנט לצבוע אורגני קטן מורכב epitope יחיד, כגון צבע מרחיקות אדום ניאון, ומפחית את המורכבות של אוכלוסיית התא המבודדת.
לאחר התאים הם biotinylated-antigen ו adsorbed צבען streptavidin מרחיקה ניאון האדום, הם מועשרים באמצעות חלקיקים מגנטיים אנטי מרחיקות אדום ניאון צבען מצומדות. חלקיקים אחת אינם מזוהים על ידי cytometers הזרימה ביותר ולכן אין צורך להסיר לפני טיהור ידי FACS מיון מבחנים במורד זרם 16. מבחר מגנטי עבור תאי B אנטיגן ספציפי מעשיר את האוכלוסייה של עניין, ומבטל את הזמן והעלות של מיון אירועים נדירים באמצעות cytometer זרימה.
להלן אנו מציגים תוצאות נציג מהעשרה של תאי B טטנוס-toxoid ספציפי של נושא לפני ושבעה ימים לאחר חיסון מגבר toxoid טטנוס. בחרנו היישום המסוים הזה כדוגמה כדי להדגים את היכולת של שיטה זו להעשיר תאי B אנטיגן ספציפי הבאים חריפה גירוי vivo. כאשר מצמידים עם תזרים cytometry, שיטה זו היא מסוגלת מעשירה ומבדל אנטיגן ספציפי נאיבי, זיכרון,plasmablast B תאים מאפשרים לחוקר לעקוב שינויים בתדירות שלהם לאורך זמן. בנוסף, אנו כוללים אחר assay במורד אפשרי, למשל ב assay ELISPOT, אשר מראה כי תאים לשמור על היכולת להפריש נוגדנים הבאים עשרה. יישום נוסף של שיטה זו עשויה להיות כרוך העברת מאמצת של תאים מועשרים לתוך שורה. הראינו בעבר תאים לשמר את היכולת לפעול כפי אנטיגן הצגת תאים לתאי T אנטיגן ספציפי הבאים בידוד והעברה (מידע לא מוצג). לפיכך, יש מספר המבחנים במורד זרם האפשריים שיכול להיות מצמידים את השיטה, אשר יחד מודיע ההבנה של התגובה החיסונית אנטיגן ספציפי. תארנו את השיטה הבאה, לרבות בקרות כדי לקבוע תשואה כוללת, טוהר, תא סגולי, ומקפלים-העשרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה חדשה להשיג בידוד והעשרה של תאי B מחייב אנטיגן מדם היקפי אנושי. השיטה ישימה בקלות עכברים לרקמות אחרות, כגון בלוטות הטחול הלימפה, והוא תואם עם ניתוח שלאחר העשרת פנוטיפ תא והתפקוד (כתב יד בהכנה).
המשתמש צריך להיות מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
