Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

T hücre reseptör (TCR) T hücre kaderi karar geliştirme, kararlı duruma/homeostazı ve çevre^1,2,3‘ te antijenik stimülasyon sırasında belirler. Son teknolojileri sıralama derin genişlemesi antijen belirli T hücre yanıt içinde daha önce değersiz bir TCR çeşitlilik ortaya çıkardı. TCR çeşitlilik işlevsel olarak geniş T hücre yanıt için bir potansiyel göstermektedir. TCR dizi repertuar analizi TCR fonksiyonel deneyleri ile entegrasyon için sıralama yaklaşımlar deneysel sistemleri ve seçin sonraki fonksiyonel analiz için kullanılan vivo içinde modelleri ile uyumlu olacak şekilde tasarlanmış olmalıdır TCRs. Biz insan TCR sıra izolasyonu için etkili bir yaklaşım geliştirdik ve TCR ifade HLA insanlaşmış fareler⁴ile uyumlu bir chimeric insan/fare TCR şablon vektör içine alt klonlama aerodinamik. Heterodimeric TCRs karşılık gelen alpha ve beta zincirleri yalıtımı PCR güçlendirme tek bir hücreden her iki zincirlerinin gerektirir. Rağmen birkaç tek hücreli TCR klonlama protokol geliştirilen ve kullanılan, hiçbiri defa kolayca yüksek üretilen iş kolaylaştırılmış doğrudan bilinmeyen Vα/Vβ TCRs retroviral vektörler yeniden ifade için içinde vivo gerekli içine klonlama ile uyumlu olması ^4,5,6,7. Önceki çalışmalarda iki ana yaklaşım, ya seçerek sıra tahmin veya tüm TCR sıra^4,5,6 yükseltmek için yeterli TCR sınırlı bir bölümünü yükseltmek için kullanılan ^{, 7}. ilk yaklaşım elde edilen TCR sıralarının aşağı akım fonksiyonel analiz gerektirir pahalı silico montaj ve de novo inşaat TCR. İkinci yaklaşım tam TCR sıra sağlamasına karşın, insan sabit bölge fare modellerinde klonlanmış TCRs vivo içinde ifade ile uyumlu değildir. Yaklaşımımız TCRs in vivo fare modelleri fonksiyonel analiz ile uyumlu olacak şekilde özel olarak tasarlanmıştır. Bir verimli ve rahat tek hücre doğrudan PCR parçalarının şablon ifade vektör alt klonlama için sağlar PCR Protokolü geliştirdik.

Bizim yaklaşım iki adımda gerçekleştirilen bir son derece hassas multiplex iç içe PCR reaksiyon kullanır. İlk multiplex tepki adım 40 astar V-beta zincirler için belirli bir havuz ve 44 astar tüm V-Alfa zincirleri TCR-alfa veya TCR-beta (Tablo 1) serisi ön bilgi olmadan yükseltmek için kullanılan belirli bir havuz. İleri astar 5′ PCR ürününün dahil bir adaptör sırası vardır. Ters astar TCR sabit bölge üzerinde temel alır. Biz belirledik benzersiz kısıtlama siteleri yok insan değişken veya kavşak TCR bölgeler ve bunlar yeni redesigned TCRα ve TCRβ astar (şekil 1) içine dahil. İkinci iç içe geçmiş tepki olarak bir astar olarak adaptörü sırası için belirli ve sürekli bölgesi içinde iç içe geçmiş bir ters astar daha da artan özgüllük ile (Tablo 1, şekil 1) TCR zincir yükseltmek için kullanılır. Tek hücre izolasyon sonra iki PCR yuvarlar (ilk tepki Vα ve Vβ astar havuzu olan ve ikinci adaptör astar ile) neden doğrudan şablon retroviral vektör alt klonlanmış bir PCR ürünü olup. Son TCR yapı, bir tek açık okuma çerçevesi (ORF), ‘kendi kendine sıyırmada’ protein sırayla bağlı fare sürekli bölgeleri ile birlikte insan değişken bölgeler içinde kodlar P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)⁸. P2A sırası birden çok sistemlerinde kullanılan ve TCRs^8,9,10,11Ifade özellikle kapsamlı olarak sınanmıştır. Her ne kadar sonra çeviri P2A sıra kalır çoğu bağlı için C-terminus beta zinciri sinyal sıra ek bir prolin, bu değişiklik ise esnek bir bağlayıcı tarafından bağlı Alfa zincirinin TCR işlevi üzerinde zararlı bir etkisi yoktur. Fare sürekli bölgesi insan yerine yapısında sinyal akış yönündeki bileşenlere ile potansiyel değişmiş etkileşimleri önlemek için kullanılır ne zaman fare hücrelerinde yeniden dile getirdi. Tek ORF alpha ve beta zincirleri^9,11stokiometrik ayrı ifade neden olur. Geçerli protokol reaktifler ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar dayanmaktadır ve aerodinamik ve verimli bir şekilde yapılması için tasarlanmıştır. Biz özellikle otoimmün diyabet karıştığı self-reactive T hücrelerden TCRs tahlil için bu tekniği kullanmış olsa da, biz bu protokolü kimlik ve insan TCRs için belirli bir işlevsel değerlendirme için yaygın olarak uygulanabilir olabilir tahmin Otoimmün epitopları, kanser epitopları veya yanıt patojenlerin ve aşılar.