Упорядочение одноклеточного TCR изоляции и поколения ретровиральных векторов для In Vitro и In Vivo выражение человека TCRs

Т-клеточных рецепторов (TCR) диктует решение судьбы Т-клеток во время разработки, установившемся/гомеостаза и антигенной стимуляции в периферии^1,2,3. Недавнее расширение глубоких технологий виртуализации обнаружила ранее underappreciated TCR разнообразия в антиген Т-клеток конкретных ответов. TCR разнообразия предполагает потенциал для функционально широкий Т-клеток ответов. Для того, чтобы интегрировать анализ репертуар последовательности TCR с TCR функциональных анализов, последовательности подходов должны быть призваны быть совместимы с экспериментальных систем и в естественных условиях модели используются для последующего функционального анализа выберите TCRs. Мы разработали эффективный подход для человека TCR последовательности изоляцию и рационализированы югу клонирования в совместимы с TCR выражение HLA-очеловеченное мышей⁴вектор TCR шаблон химерных человека и мыши. Изоляции соответствующего альфа и бета-цепи гетеродимерная TCRs требует амплификации PCR обеих цепей из одной клетки. Хотя, несколько одноклеточных TCR клонирования протоколы были разработаны и использованы, никто до настоящего времени были легко совместим с высокой пропускной способностью обтекаемый прямого клонирования неизвестных Vα/Vβ TCRs в ретровиральных векторов необходимых для повторного выражения в естественных условиях ^4,5,6,7. Предыдущие исследования использовали два основных подхода, либо выборочно дополнить ограниченную часть TCR, достаточных для экстраполяции последовательность, или усилить весь TCR последовательности^{4,5,6 , 7}. ниже по течению функционального анализа последовательностей TCR, полученные через первый подход требует дорогостоящих в silico Ассамблеи и de novo строительство TCR. В то время как второй подход обеспечивает полную последовательность TCR, регионе человека постоянно не совместим с в vivo выражение клонированного TCRs в моделях мыши. Наш подход разработан специально для совместимости с в vivo функционального анализа TCRs в моделях мыши. Мы разработали эффективный и рациональный Одноячеистый PCR протокол, который позволяет для прямого югу клонирования PCR фрагментов в векторные выражения шаблона.

Наш подход использует весьма чувствительной реакции PCR мультиплекс вложенных, которая выполняется в два этапа. В первый мультиплекс реакции шаг бассейн 40 праймеров для всех V-бета-цепи и бассейн 44 праймеров для все, что V-альфа-цепи используются для усиления TCR альфа или бета-TCR без предварительного знания о последовательности (Таблица 1). Форвард грунт имеет адаптер последовательность, которая включена в 5′ продукта PCR. Обратный грунт на основе постоянной региона TCR. Мы определили места уникальные ограничения, которые отсутствуют от человека переменной или перекрестка TCR регионов и включили их в обновленным TCRα и TCRβ грунты (рис. 1). В втором вложенных реакции грунт, определенных для адаптера последовательности и вложенного обратного грунт в регионе постоянно используются для дальнейшего усиления TCR цепи с повышенной точностью (Таблица 1, рис. 1). После изоляции одной ячейки, два раунда ПЦР (первая реакция с бассейном праймеров Vα и Vβ и второй с праймерами адаптер) результат ПЦР продукта, который может быть непосредственно югу клонирован в шаблон антиретровирусные вектор. Окончательный TCR конструкция будет кодировать в одном открытом чтения рамке (ORF), человека переменной регионах, в сочетании с постоянной регионов мыши соединены «самостоятельно расщепления» последовательности белка, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)⁸. P2A последовательность была использована в нескольких системах и были тщательно протестированы специально для выражения TCRs^8,9,10,11. Хотя, после перевода, придает большую часть останков P2A последовательности C-конечная альфа-цепи соединены гибкими компоновщик, в то время как последовательность сигнала цепи бета-версия имеет дополнительные пролина, эта модификация не пагубно влияет на функции TCR. Регионе постоянный мыши используется в конструкции вместо человека во избежание потенциальных изменены взаимодействий с сигнальных компонентов нисходящего потока при вновь выразил в клетки мыши. Один ORF приведет к стехиометрическим отдельные выражения альфа и бета-цепи^9,11. Текущий протокол основан на реагенты и подходы, которые широко доступны и призвана осуществляться на рациональной и эффективной основе. Хотя специально для анализа TCRs от самореактивных Т-клеток, причастны аутоиммунный диабет мы использовали этот метод, мы ожидаем, что этот протокол может быть широко применяется для идентификации и функциональной оценки человеческого TCRs для аутоиммунная epitopes, рака эпитопов или ответы на патогенные микроорганизмы и вакцин.