Razionalizzato isolamento di singole cellule TCR e generazione di vettori retrovirali per In Vitro e In Vivo l'espressione del TCR umano

T cell receptor (TCR) detta decisione di destino delle cellule T durante lo sviluppo, stato stazionario/omeostasi e stimolazione antigenica in periferia^1,2,3. Recente espansione delle tecnologie di sequenziamento profondo ha scoperto una diversità TCR precedentemente poco apprezzata all’interno di risposte specifiche delle cellule di T di antigene. Diversità TCR suggerisce un potenziale per le risposte delle cellule T funzionalmente ampio. Al fine di integrare l’analisi di repertorio TCR sequenza con saggi funzionali TCR, gli approcci di sequenziamento dovrebbero essere progettati per essere compatibile con sistemi sperimentali e in vivo modelli utilizzati per la successiva analisi funzionale di select TCR. Abbiamo sviluppato un approccio efficace per l’isolamento di sequenza umana del TCR e razionalizzato Sub-clonazione in un vettore di modello TCR chimerico umano/mouse compatibile con espressione TCR in topi umanizzati HLA⁴. Isolamento delle relative catene alfa e beta del TCR heterodimeric richiede l’amplificazione di PCR di entrambe le catene da una singola cellula. Anche se, diversi protocolli clonazione di singole cellule TCR sono stati sviluppati e utilizzati, nessuno finora sono stati facilmente compatibile con alto-rendimento aerodinamico clonazione diretta di sconosciuto Vα/Vβ TCR in vettori retrovirali necessari per ri-espressione in vivo ^4,5,6,7. Precedenti studi hanno utilizzato due approcci principali, sia per amplificare selettivamente una porzione limitata del TCR sufficiente per estrapolare la sequenza, o per amplificare l’intero TCR sequenza^{4,5,6 , 7}. analisi funzionale a valle di TCR sequenze ottenute tramite il primo approccio richiede costose in silico un costruzione assemblaggio e de novo del TCR. Mentre il secondo approccio prevede la sequenza completa di TCR, regione costante umana non è compatibile con l’espressione in vivo del TCR clonato in modelli murini. Il nostro approccio è specificamente progettato per essere compatibile con in vivo analisi funzionale di TCR in modelli murini. Abbiamo sviluppato un’efficiente e snella singola cella protocollo PCR che consente per sub-clonazione diretta di frammenti PCR nel vettore di espressione di modello.

Il nostro approccio utilizza un’altamente sensibile reazione di PCR multiplex-nidificati che viene eseguita in due fasi. Nella prima reazione multiplex passo una piscina di 40 primer specifici per tutte le catene di V-beta e una piscina di 44 primer specifici per tutte le catene di V-alfa sono utilizzate per amplificare il TCR-alfa o TCR-beta senza la preventiva conoscenza della sequenza (tabella 1). Il primer forward ha una sequenza di adattatore, che è incorporata in 5′ del prodotto della PCR. Il primer reverse si basa sulla regione costante del TCR. Abbiamo identificato siti di restrizione unici che sono assente dal variabile umana o regioni della giunzione TCR e ha incluso tali in nuova e ridisegnata, TCRα e TCRβ primer (Figura 1). Nella seconda reazione nidificata, un primer specifico per la sequenza di adattatore e un primer reverse nidificato all’interno della regione costante sono utilizzati per amplificare ulteriormente le catene TCR con specificità aumentata (tabella 1, Figura 1). Dopo isolamento di singole cellule, due tondi di PCR (reazione prima con un pool di primer sia Vα e Vβ e in secondo luogo con gli iniettori adattatore) portano a un prodotto PCR che può direttamente essere sub-clonato nel vettore retrovirale modello. Il costrutto TCR finale codificherà, in una cornice unica lettura aperta (ORF), umane regioni variabili combinate con regioni costante del mouse collegate di sequenza della proteina ‘self-che fende’, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)⁸. La sequenza P2A è stata utilizzata nei sistemi multipli ed è stato ampiamente testata in modo specifico per l’espressione del TCR^8,9,10,11. Anche se, dopo traduzione la maggior parte del P2A sequenza rimane attaccata al C-terminale della catena alfa collegato da un linker flessibile, mentre la sequenza di segnale catena beta ha un’ulteriore prolina, questa modifica non ha alcun effetto negativo sulla funzione TCR. La regione costante del mouse viene utilizzata nel costrutto anziché umani per evitare potenziali interazioni alterate con componenti di segnalazione a valle quando ri-espressa in cellule di topo. Il singolo ORF si tradurrà in espressione separata stechiometrico di alfa e beta catene^9,11. Il protocollo attuale è basato su reagenti e approcci che sono ampiamente disponibili ed è stato progettato per essere eseguita in modo snello ed efficiente. Anche se abbiamo usato questa tecnica in particolare test TCR da cellule T autoreattive implicate nel diabete autoimmune, prevediamo che questo protocollo può essere ampiamente applicabile per l’identificazione e la valutazione funzionale di umano TCR specifico per epitopi autoimmuni, cancro epitopi o risposte a patogeni e vaccini.