יעיל בידוד TCR תא בודד, דור של וקטורים Retroviral עבור במבחנה In Vivo הביטוי של האדם TCRs
Summary
המשלב בפרוטוקול הנוכחי לתא בודד לזווג אדם TCR אלפא, ביתא שרשרת רצף עם אווירודינמית דור תואם במבחנה ויוו TCR והביטוי retroviral וקטורים.
Abstract
למרות זאת, פותחו מספר שיטות רצף של תא T מזווג קולטן (TCR) שרשראות אלפא, ביתא מתאי T יחיד, אף אחד עד כה להצטיינות במורד הזרם ויוו אנליזה פונקציונלית של TCR heterodimers. פיתחנו פרוטוקול משופר מבוסס על שני שלבים מולטיפלקס-מקונן PCR, כשהתוצאה היא מוצר ה-PCR המתפרס על כל משתנה מחוזות האדם TCR אלפא ביתא רשתות. על ידי זיהוי אתרים ייחודיים הגבלת שילוב אותם תחל ה-PCR, עשינו את המוצר PCR תואם ישירה תת שיבוט לתוך תבנית retroviral וקטור. הבונה retroviral וכתוצאה מכך מקודד chimeric האדם/TCR עם העכבר העכבר מחשבים תאיים, אשר מתפקד בתאי עכבר או במודלים העכבר ‘ ויוו . בסך הכל, הפרוטוקול המתואר כאן משלב האנושי תא בודד לזווג TCR אלפא, ביתא שרשרת הזדהות עם דור יעילה וישימה ברצון retroviral וקטורים לביטוי TCR במבחנה , ויוו . הוידאו והחומרים הנלווים מתוכננים לתת תיאור מפורט מאוד של התא הבודד PCR, כך לשלבים הקריטיים יכול להיות החסרונות שהופעלו ופוטנציאליים להימנע. בנוסף, אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים שיבוט הדרושים ליצור ביטוי וקטור. לאחר mastered, כל התהליך מתא יחיד מיון לביטוי TCR יכול להתבצע תוך תקופה קצרה של שבועיים.
Introduction
הקולטן תא T (TCR) מכתיבה תא T ההחלטה לגורל במהלך הפיתוח, מצב יציב/הומאוסטזיס, גירוי antigenic לפריפריה1,2,3. הרחבת האחרונות עמוק רצף טכנולוגיות חשף מגוון TCR בעבר מעריכים בתוך אנטיגן ספציפי תא T תגובות. TCR גיוון מצביע על פוטנציאל תא T פונקציונלית רחבה של תגובות. על מנת לשלב את ניתוח רפרטואר של רצף TCR עם TCR מבחני פונקציונלי, הגישות רצף צריך להיות מתוכנן כך שיהיה תואם מערכות ניסויית ומודלים ויוו מנוצל לניתוח פונקציונלי עוקבות של בחירה TCRs. לנו יש פיתח גישה יעילה עבור האדם TCR רצף בידוד של תת שיבוט לתוך TCR אדם chimeric/עכבר תבנית וקטורית תואם TCR ביטוי עכברים humanized הלע4. בידוד של שרשראות אלפא, ביתא המתאים של heterodimeric TCRs דורש הגברה PCR של שתי שרשראות של תא בודד. למרות, יש TCR תא בודד מספר פרוטוקולים שיבוט פותחה, מנוצל, אף אחד עד כה בקלות תואם עם תפוקה גבוהה יעיל ישירה שכפול של TCRs Vα/Vβ לא ידוע לתוך הכרחי עבור הביטוי מחדש ויוו retroviral וקטורים 4,5,6,7. מחקרים קודמים נעזרו שתי גישות הגדולות, גם להגביר באופן סלקטיבי של חלק מוגבל TCR מספיקות כדי לנחש את הרצף או כדי להגביר את כולו TCR רצף4,5,6 , 7. אנליזה פונקציונלית במורד הזרם של רצפי TCR להשיג באמצעות הגישה הראשונה דורשת יקר סיליקו הרכבה דה נובו בנייה של TCR. בעוד הגישה השניה מספק את רצף TCR מלאה, באזור קבוע האנושית אינה תואמת ויוו ביטוי TCRs משובטים במודלים של העכבר. הגישה שלנו היא תוכננה במיוחד כדי שיהיה תואם ויוו אנליזה פונקציונלית של TCRs במודלים של העכבר. פיתחנו מפושטת ויעילה יחיד תא PCR פרוטוקול המאפשר ישירה תת שיבוט של PCR קטעים לתוך תבנית הביטוי וקטור.
הגישה שלנו מנצל רגישה מאוד מולטיפלקס-מקונן PCR תגובה מבוצעת בשני שלבים. התגובה הראשונה מולטיפלקס בשלב שלולית ספציפיות עבור כל הרשתות V-בטא 40 תחל ובריכה של 44 תחל ספציפיים עבור כל הרשתות V-אלפא משמשים כדי להגביר את TCR-אלפא או בטא TCR ללא ידיעת מוקדמת של הרצף (טבלה 1). פריימר לפנים יש רצף מתאם, שסופחה לתוך 5′ של המוצר ה-PCR. ומהצמיגים הפוכה מבוססת על אזור קבוע TCR. זיהינו הגבלת ייחודי אתרים, נעדרו למשתנה האנושי או צומת TCR אזורים, ושילבו האלה לתוך תחל TCRα ו- TCRβ נייווי (איור 1). התגובה השניה מקוננים, פריימר ספציפיות עבור הרצף מתאם ו פריימר הפוכה מקוננים בתוך אזור קבוע משמשים כדי להגביר עוד יותר את השלשלאות TCR עם ירידה לפרטים מוגברת (טבלה 1, איור 1). לאחר בידוד תא בודד, 2 כדורים של ה-PCR (התגובה הראשונה עם מאגר של צבעי יסוד הן Vα והן Vβ, ועם השנייה תחל מתאם) במוצר ה-PCR זה יכול להיות ישירות תת משובטים לתוך תבנית retroviral וקטור. הבונה TCR הסופי לקודד, בתוך מסגרת קריאה פתוחה יחיד (ORF), אנושי אזורים משתנה בשילוב עם העכבר קבוע אזורים מחוברים על ידי הרצף חלבון ‘שהפריד עצמית’, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. רצף P2A נעשה שימוש במערכות מרובות, נבדק באופן מקיף במיוחד עבור הביטוי TCRs8,9,10,11. למרות, אחרי תרגום מרבית השרידים רצף P2A קשור קצה קרבוקסילי שרשרת אלפא מחובר באמצעות מקשר גמיש, ואילו רצף אות שרשרת ביתא של פרולין נוספים, שינוי זה יש השפעה מזיקה על תפקוד TCR. אזור קבוע העכבר נמצא בשימוש הבונה במקום האדם להימנע פוטנציאליים שינו אינטראקציות עם רכיבים איתות במורד הזרם כאשר הביע מחדש בתאי עכבר. ORF יחיד תגרום בביטוי נפרדים stoichiometric של אלפא, בטא שרשראות9,11. בפרוטוקול הנוכחי מושתת על ריאגנטים, גישות זמינים באופן נרחב, והוא נועד להתבצע בצורה מפושטת ויעילה. למרות במיוחד השתמשנו בטכניקה זו כדי assay TCRs מתאי T self-reactive מעורבים סוכרת אוטואימונית, אנו צופים כי פרוטוקול זה יכול להיות החלים נרחב עבור זיהוי והערכה תפקודית של ספציפיות עבור האדם TCRs epitopes אוטואימונית, סרטן epitopes או התגובות פתוגנים וחיסונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים שיטה יעילה עבור הגברה TCR תא בודד ו עוקבות תת שיבוט לזווג TCR אלפא ביתא רשתות לתוך תבנית הביטוי retroviral וקטור. למרות זאת, פותחו מספר פרוטוקולים PCR תא בודד, אף עד כה תואם מיידית תת שיבוט לתוך וקטור ביטוי. ברוב המקרים, רצף חלקי המקיף את האזורים CDR3 משתנה מאוד מוגבר, עם מספ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי האגודה לסוכרת נעורים 1-FAC-2014-243-A-N, עדה 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 טייס פיג’יי, ואת רוברט ג’ניס מקנייר קרן.
אנו מודים Pena סנדרה ומקדונלד Andrene על גיוס החולה, סמואל בלום לקבלת סיוע טכני, ד ר ג’ורג Makedonas על המתנה של נוגדנים ושליטה DNA משמש PCR אופטימיזציה.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
References
- Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).
- Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).
- Tubo, N. J., et al. Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection. Cell. 153 (4), 785-796 (2013).
- Sprouse, M. L., et al. Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice. J Immunol Methods. , (2016).
- Lennon, G. P., et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).
- Dash, P., et al. Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).
- Kobayashi, E., et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J Vis Exp. (113), (2016).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).
