Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs

Der T-Zell-Rezeptor (TCR) schreibt T-Zell-Schicksal-Entscheidung während der Entwicklung, Steady-State/Homöostase und Antigenen Stimulation in der Peripherie^1,2,3. Jüngste Erweiterung der Deep sequencing Technologien hat eine bisher unterschätzte TCR Vielfalt in Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten aufgedeckt. TCR Vielfalt schlägt ein Potenzial für funktional Breite T-Zell-Reaktionen. Um die Sequenzanalyse Repertoire TCR TCR funktionale Tests zu integrieren, sollten die Sequenzierung Ansätze entworfen werden, kompatibel mit experimentellen Systemen und in Vivo Modelle für nachfolgende Funktionsanalyse der SELECT-Anweisung verwendet werden TCR. Wir haben einen effizienten Ansatz für menschliche TCR Sequenz Isolation entwickelt und gestrafft, vor-Klonen in einen Chimären Mensch/Maus TCR Vorlage Vektor mit TCR Ausdruck in HLA-humanisierten Mäuse⁴kompatibel. Isolation der entsprechenden Alpha- und Beta-Ketten des heterodimerisierenden TCR verlangt PCR Verstärkung der beiden Ketten aus einer einzigen Zelle. Obwohl einige einzellige TCR Klonen Protokolle entwickelt und genutzt haben, wurden keiner bisher problemlos kompatibel mit Hochdurchsatz-optimierte direkte Klonen unbekannter Vα/Vβ TCRs in retrovirale Vektoren für erneuten Ausdruck in-vivo notwendig ^4,5,6,7. Frühere Studien haben zwei Hauptansätze, entweder um einen begrenzten Teil des TCR ausreichend, um die Sequenz zu extrapolieren oder verstärken die gesamte TCR Sequenz^4,5,6 selektiv zu verstärken genutzt. ^{, 7}. Downstream Funktionsanalyse des TCR Sequenzen erhalten über den ersten Ansatz erfordert kostspielige in Silico Montage und de Novo Bau TCR. Während der zweite Ansatz die komplette TCR-Sequenz bietet, ist die menschliche konstante Region nicht in Vivo Ausdruck der geklonten TCRs in Mausmodellen vereinbar. Unser Ansatz ist speziell mit in Vivo Funktionsanalyse des TCR in Maus-Modellen kompatibel. Wir entwickelten eine effiziente und schlanke einzelligen PCR-Protokoll, das für direkte vor-Klonen der PCR-Fragmente in der Vorlage Expressionsvektor ermöglicht.

Unser Ansatz nutzt eine hochsensible Multiplex verschachtelten PCR-Reaktion, die in zwei Schritten durchgeführt wird. In der ersten Multiplex-Reaktion Schritt einen Pool von 40 Primer speziell für die V-Beta-Ketten und einen Pool von 44 Primer speziell für alles, was die V-Alpha-Ketten verwendet werden, um die TCR-Alpha oder TCR-Beta ohne Vorkenntnisse der Sequenz (Tabelle 1) zu verstärken. Der forward Primer hat eine Adapter-Sequenz, die in der 5′ des PCR Produktes aufgenommen wird. Die rückwärts-Primer basiert auf die konstante Region der TCR. Wir haben ermittelt, einzigartige Restriktionsschnittstellen, die aus menschlichen Variable oder Kreuzung TCR Regionen fehlen, und integriert diese in neu gestalteten TCRα und TCRβ Primern (Abbildung 1). In der zweiten verschachtelte Reaktion eine Grundierung, die spezifisch für die Adapter-Sequenz und einer verschachtelten rückwärts-Primer in der konstanten Region dienen weiter verstärken die TCR-Ketten mit erhöhte Spezifität (Tabelle 1, Abb. 1). Nach einzelnen Zelle isoliert, zwei Runden der PCR (erste Reaktion mit einem Pool von Vα und Vβ Primern, und zweitens mit Adapter Primern) führen ein PCR-Produkt, das direkt in die Vorlage retroviral Vektor Sub geklont werden kann. Das endgültige TCR-Konstrukt wird in eine einzelne offene Leserahmen (ORF), menschlichen Variablen Regionen kombiniert mit Maus konstante Regionen durch die “Self anhaftenden” Proteinsequenz verbunden kodieren P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)⁸. Der P2A-Sequenz wurde in mehreren Systemen eingesetzt und wurde speziell für den Ausdruck von TCR^8,9,10,11ausgiebig getestet. Obwohl, nach Übersetzung P2A Sequenz bleibt der Großteil an dem C-Terminus der alpha-Kette durch eine flexible Linker verbunden, während der Beta-Kette Signalsequenz eine zusätzliche Prolin, diese Änderung hat hat keine nachteiligen Auswirkungen auf die TCR-Funktion. Die konstante Region der Maus wird in das Konstrukt statt Menschen verwendet, um mögliche veränderte Interaktionen mit nachgeschalteten Signalisierung Komponenten zu vermeiden wenn wieder in Mauszellen exprimiert. Die einzige ORF führen stöchiometrische separater Ausdruck von Alpha- und Beta-Ketten^9,11. Das aktuelle Protokoll basiert auf Reagenzien und Ansätze, die überall erhältlich sind, und soll in einer schlanken und effizienten Art und Weise durchgeführt werden. Obwohl wir diese Technik speziell zur TCR von selbstzersetzliche T-Zellen in autoimmune Diabetes verwickelt assay verwendet haben, erwarten wir, dass dieses Protokoll allgemein anwendbar zur Identifizierung und funktionelle Beurteilung menschlichen TCRs spezifisch für sind autoimmune Epitope, Krebs Epitope oder Reaktionen auf Krankheitserreger und Impfstoffe.