Summary

전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙

Published: May 06, 2017
doi:

Summary

심장 biowire 플랫폼은 전기 자극 3 차원 세포 배양을 조합하여 인간 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래 심근 (hPSC-CM)를 숙성에 사용되는 시험 관내 방법. 이 원고는 심장 biowire 플랫폼의 자세한 설정을 제공합니다.

Abstract

인간 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMS)은 유망한 셀 원천이되어있다, 따라서 약물 발견, 질병 모델링, 조직 공학 및 재생 의학을 포함한 심장 연구에서의 응용 가능성의 조사를 격려했다. 그러나, 기존의 프로토콜에 의해 생산 세포는 네이티브 성인 심실의 심근에 비해 미성숙의 범위를 표시합니다. 많은 노력은 지금까지 달성 완만 한 성숙으로, hPSC-CM이 성숙되었습니다. 따라서 biowire라는 설계 시스템은, 시험 관내에서 성숙 상태 hPSC-CMS에 이끌 물리적 및 전기적 신호를 모두 제공하여 고안되었다. 시스템 I은 점진적으로 증가하는 주파수 전기장 자극을 받는다 정렬 심장 조직 (biowire)에 조립 강성 템플릿 봉합사 따라 겔화 콜라겐 타입 hPSC-CMS에 시드하는 미세 플랫폼을 사용한다. nonstimulated 컨트롤에 비해,biowired 심근 구조적 및 전기 생리 학적 성숙의 강화 정도를 나타내는 자극. 이러한 변화는 자극의 속도에 따라 달라집니다. 이 원고는 구체적으로 biowires의 설계 및 제작에 대해 설명합니다.

Introduction

세포 기반 치료는 심장 수리 / 재생을 달성하기 위해 가장 유망한 및 조사 전략 중 하나입니다. 그것은 심장 조직 공학 및 생체 재료 1, 2의 공동 배달의 도움되었습니다. 대부분의 가능한 셀 소스 손상, 질병, 또는 세 마음 3에 잠재적으로 유익한 효과에 대한 동물 모델에서 연구되고있다. 특히, 상당한 노력이 인간 만능 줄기 세포를 사용되었습니다 (hPSC)은 심근 세포 (hPSC-CM), 심장 조직 공학에 대한 잠재적으로 무제한자가 세포 소스 – 유래. hPSC-CMS는 몇몇 확립 된 프로토콜 4, 5, 6을 사용하여 제조 될 수있다. 그러나, 수득 된 세포는 성체 심실의 심근 대비 7 미성숙 특성의 범위와 태아의 형상 표현형을 표시 </sup> 8. 이는 신약 개발 연구에 성인 심장 질환 모델 (9)의 개발에 성인 심장 조직의 모델로 hPSC-의 CM 응용 프로그램에 장애물이 될 수 있습니다.

표현형 미숙의 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 접근 방식을 적극적으로 심근의 성숙을 촉진하기 위해 조사되었다. 초기 연구는 순환 기계 (10) 또는 전기 자극 (11)을 통해 신생아 래트 심근 세포의 효과적인 친 성숙 특성을 밝혀. 젤 압축 및 고리 기계적 자극은 또한 전기 생리 칼슘 취급 특성의 향상과 최소 hPSC-CM 성숙 (12, 13)의 일부 측면을 개선하는 것으로 나타났다. 따라서, "생물학적 와이어"(biowire)라는 플랫폼 시스템은 큐 구조와 전계 stimulatio 모두를 제공하여 고안된N은 hPSC의 CM-14의 성숙을 증진한다. 이 시스템은 전기장 자극 의무가 정렬 된 심장 조직을 만들기 위해 미세 플랫폼을 사용한다. 이것은 hPSC-CM이의 구조 및 전기 생리학적인 성숙을 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 biowires을의 세부 사항을 설명합니다.

Protocol

1. 마스터 디자인 및 제작 참고 : 장치 제조를위한 소프트 리소그래피를 사용합니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 성형 용 이층 SU-8을 마스터. 장치 (왼쪽 그림 1A) 디자인을 사용하고 제도 소프트웨어를 디자인합니다. 별도로 마스터의 각 층을 그린다. 마스터 (15)의 두 개의 층에 대응하는, dpi로 20,000 개의 포토 마스크에서 디바이스 디자인 ?…

Representative Results

biowires의 봉합사를 사용하는 이성 한 축에 정렬하고 심장 섬유의 형상을 모방하는 3 차원 구조물의 형성을위한 템플릿으로서 역할을한다. 우리는 biowire 문화의 7 일 후에, 세포가 봉합 (그림 3A)의 주위에 젤을 개조 한 것으로 나타났습니다. 봉합사의 축을 따라 어셈블 세포는 심장 조직 (도 3)를 배열 형성한다. 예비 배양 7 일 후, 7 biowires 전기장 자?…

Discussion

이 원고는 hPSC-CM의 성숙을 향상시키기위한 엔지니어링 플랫폼 인 biowire의 설정과 구현을 설명합니다. 이 장치는 표준 미세 제조 시설에서 만들 수 있으며, 바이오 와이어는 일반적인 세포 배양 기술과 전기 자극기로 생산할 수 있습니다.

우리가 알기로는, 바이오 와이어와 비슷한 방법은보고 된 바 없다. 이 전략은 개선 된 성숙 특성이보다 높은 자극 속도 상승 요법 (6Hz 대 3H…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 보조금의 원조 심장에서 지원되었다 스트로크 캐나다 (G-14-0006265)의 재단, 건강 연구 (137352 및 143066), 그리고 JP 비켈 보조금의 캐나다 연구소에서 운영 보조금 (1013821 ) SSN합니다.

Materials

L-Ascorbic acid Sigma A-4544 hPSC-CM culture media componet
AutoCAD Autodesk, Inc Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail BD Biosciences 354249 Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I  Sigma C0130 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I) EMD Millipore 260913-25MU Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) Dremel Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator Grass s88x
Fetal bovine serum (FBS) WISENT Inc. 080-450
D-(+)-Glucose  Sigma G5767 Collagen gel component
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
H2O MilliQ 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES Sigma H4034 Collagen gel component
Hot plate Torrey Pines HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053
Mask aligner EVG  EVG 620
Matrigel, growth factor reduced  Corning 354230 Collagen gel component
Medium 199 (M199) Thermo Fisher Scientific 11150059 Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG) Sigma M-6145 hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker VWR 89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific 15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+  Thermo Fisher Scientific 14040133
Plate (6-well) Corning 353046
Plate (6-well), low attachment Corning 3471
Platinum wires, 0.2 mm Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Doe & Ingalls Inc. To develop the wafer
Pouch, peel-open Convertors 92308 For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761 Collagen gel component
Sodium hydroxide Sigma S8045 Collagen gel component
Sprin coater Specialty Coating Systems G3P-8
StemPro-34 culture medium Thermo Fisher Scientific 10639011 hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media  Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50  MicroChem Corp. photoresist, master component
SU-8 2050  MicroChem Corp. photoresist, master component
Transferrin Roche 10-652-202 hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25% Thermo Fisher Scientific 25200056 hPSC-CM culture media componet
Wash medium IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin

References

  1. Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
  2. Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
  3. Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
  4. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
  5. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  6. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  7. Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
  8. Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
  9. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  10. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
  11. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
  12. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
  13. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  14. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  15. Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
  16. Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
  17. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  18. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
  19. Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).

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Cite This Article
Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).

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