細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

ポリアクリルアミド基質の1製作きれいなガラス基板 – 細胞培養の際に最適なポリアクリルアミドハイドロゲルの製造と整合性を確保するために – エンドポイント免疫蛍光またはグラスボトムTFMのための35ミリメートルペトリ皿のための標準的な顕微鏡スライドのいずれか。あるいは、使用は、ガラス基板を予備洗浄します。 蒸留水（のdH 2 O）にトリトンX-100V / 0.25％Vでガラス基板を浸します。 30分間、オービタルシェーカー上の基板を置きます。 トリトンX-100溶液を除去し、30分間、オービタルシェーカー上で最後のすすぎと場所に浸漬のdH 2 O脱退基板と基板を5回すすいでください。 dH 2 Oを削除し、アセトン中に基板を浸します。 30分間、オービタルシェーカー上の基板を置きます。 アセトンを除去し、メタノールに基板を浸します。 30分間、オービタルシェーカー上の基板を置きます。 メタノールを除去およびDHで基板を5回すすぎ<1時間オービタルシェーカー上でサブ> 2 O浸し0.05 N NaOH中で基質と場所。 注意：NaOHを高度に苛性であり、重篤な皮膚の薬傷・眼の損傷を引き起こす可能性があります。保護手袋、衣服、目の保護具を着用します。 NaOH溶液を外し、のdH 2 Oを使用して基板を5回すすぎ、基板を乾燥し、乾燥するまでホットプレート上で110℃で焼成することが圧縮空気をろ過（5から15分）。洗浄された基板は、無期限に室温で保存することができます。 ポリアクリルアミドヒドロゲルの付着を確実にするために、きれいなガラス基板Silanize。 エタノール中の新たに調製した2％v / vの3-（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート（3-TPM）で清浄なガラス基板を浸します。 30分間、オービタルシェーカー上の基板を置きます。 注意：3-TPMは、可燃性液体です。熱、火花、裸火、および高温のものから遠ざけると化学ドラフト内でのみ使用します。 3-TPMソリューションを削除し、ETHA内の基板を浸しますNOL。 5分間オービタルシェーカー上の基板を置きます。 （ – 15分5）基板を乾燥し、乾燥するまでホットプレート上で110℃で焼くために濾過圧縮空気を使用してください。シラン処理基材は、最大1ヶ月間室温で保存することができます。 オプション1：エンドポイントの免疫蛍光のためのシラン化顕微鏡スライド上にポリアクリルアミドハイドロゲルを作製。 所望のアクリルアミド/ビスアクリルアミドの割合での dH 2 O中でプレポリマー溶液を調製し（w / v）の4キロパスカル（4％アクリルアミド、0.4％ビスアクリルアミド）のヤング率を有する基板を製造する比率、13キロパスカル（6％アクリルアミド、0.45温家宝首相らあたり％ビスアクリルアミド）、または30キロパスカル（8％アクリルアミド、0.55％ビスアクリルアミド）と同様の気孔率、。 41。 0.2μmのシリンジと渦透明になるまで溶液およびフィルター。プレポリマー溶液は、3ヶ月間4℃で保存することができます。 注意：アクリルアミドまたはビスアクリルアミドへの暴露はneurot、急性毒性をもたらすことができますoxicity、および刺激。保護手袋、衣服、目の保護具を着用します。 メタノール中で重量/体積のIrgacure 2959年20％の光開始剤溶液を調製します。この光開始剤溶液は、保存することができず、新鮮なたびを準備する必要があります。 1（プレポリマー：光開始剤）比9にプレポリマー及び光開始剤溶液を混合。必要に応じて、気泡を除去するために15分間真空室で脱気。 1プレポリマー：9のガラス乾燥トレイとピペット100μLにシラン化スライドを置き、各スライドの上に光開始剤水溶液。泡の生成を回避しながら、ゆっくりと22×60ミリメートルのカバーガラスと各スライドをカバーしています。カバーガラスは、酸素による重合反応の阻害を防止することに注意してください。 UV架橋剤に入れ乾燥トレイと10分（4 W / m 2）で365 nmのUV Aにスライドを公開します。必要に応じて重合時間を最適化します。長いエクスポージャーのリスク困難overpolymerizationによるカバースリップを取り除きます。短い暴露rをISKのunderpolymerizationと低ヒドロゲルの安定性。 5分間のdH 2 Oにヒドロゲルを浸します。重合ヒドロゲルを損傷しないように注意しながら、かみそりでカバースリップを削除します。 dH 2 O毎日を変え、3日間- 1のための室温での dH 2 Oにヒドロゲルを残します。最大3ヶ月間 – （30分15）と、室温で保存し、乾燥するまでホットプレート上で50℃でハイドロゲルを脱水。 オプション2：TFMを使用して、細胞 – 基質相互作用のライブ評価のためのシラン化35mmのガラスボトムペトリ皿上の蛍光ビーズを含むポリアクリルアミドハイドロゲルを作製。 凝集体を分散させるために15分間1μmの蛍光ビーズのストック溶液を超音波処理します。 （w / v）の比が4キロパスカル（4％アクリルアミド、0.4％ビスアクリルアミド）のヤング率を有する基板を製造するために、所望のアクリルアミド/ビスアクリルアミドの割合での dH 2 O中でプレポリマー溶液を調製し13キロパスカル（6％アクリルアミド、0温家宝首相らあたり0.45パーセントビスアクリルアミド）、または30キロパスカル（8％アクリルアミド、0.55％ビスアクリルアミド）と同様の気孔率、。 41。 0.2μmのシリンジと渦透明になるまで溶液およびフィルター。プレポリマー溶液は、3ヶ月間4℃で保存することができます。 注意：アクリルアミドまたはビスアクリルアミドへの曝露は、急性毒性、神経毒性、および刺激をもたらすことができます。保護手袋、衣服、目の保護具を着用します。 混合するために0.2％v / vの渦の最終濃度でプレポリマー溶液に蛍光ビーズを加えます。 メタノール中で重量/体積のIrgacure 2959年20％の光開始剤溶液を調製します。この光開始剤溶液は、保存することができず、新鮮なたびを準備する必要があります。 1（プレポリマー/ビーズ：：光開始剤）比9におけるプレポリマー/ビーズおよび光開始剤溶液を混合。必要に応じて、気泡を除去するために15分間真空室で脱気。 ガラス乾燥トレイとpにシラン化35mmのガラスボトムペトリ皿を置きます1プレポリマー/ビーズ：9のIPET 20μL、各皿の中央への光開始剤水溶液。泡の生成を回避しながら、ゆっくりと12ミリメートルの円形カバーガラスで各スライドをカバーしています。カバーガラスは、酸素による重合反応の阻害を防止することに注意してください。 らノール当たり、ヒドロゲルの表面に蛍光ビーズを分配皿を反転し、20分間室温で残すために。 42。 まだ反転しながら、10分（4 W / m 2）で365 nmのUV Aに料理を公開します。必要に応じて重合時間を最適化します。長いエクスポージャーのリスク困難overpolymerizationによるカバースリップを取り除きます。短いエクスポージャーのリスクunderpolymerizationと低ヒドロゲルの安定性。 バッファと、暗い一晩中、室温で残す0.1 M 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）でヒドロゲルを浸します。 polymeを損傷しないように注意しながら、カミソリで慎重にカバースリップを削除しますrizedヒドロゲル。 （ – 30分15）乾燥するまでホットプレート上で50℃でハイドロゲルを脱水。ヒドロゲルは、3ヶ月間、暗所で室温で保存することができます。 配列の2製作生体分子を印刷するためにバッファを準備します。関心の生体分子への適切な印字バッファを使用してください。成長因子（GF）印刷バッファは、細胞 – 細胞リガンドのような分子の他のクラスのために広く適しています。 2×ECMタンパク質印刷バッファを準備するために、6ミリリットルのdH 2 Oボルテックスに酢酸ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の37.2 mgの164ミリグラムを追加し、完全に可溶化するために37℃でインキュベートします。可溶化の後、予熱したトリトンX-100およびグリセロールの4ミリリットルの50μLを追加します。ボルテックスとは、可溶化するために、再び37℃でインキュベートします。 4.8にpHを調整するために滴定、氷酢酸80μL – 40を追加します。 2×ECMタンパク質印刷バッファ4に格納することができます1ヶ月間Cを°。 注意：酢酸は可燃性、腐食性を示します。保護手袋、衣服、目の保護具を着用します。 2×GF印刷バッファを準備するために、6 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に105.5 mgの酢酸ナトリウム、および37.2ミリグラムのEDTAを加えます。ボルテックスとは完全に可溶化するために37℃でインキュベートします。可溶化の後、100 mgの3を追加 – [（3-コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ] -1-プロパン（CHAPS）とグリセロールの4 mLです。 2×GFタンパク質印刷バッファは、1ヶ月間、4℃で保存することができます。 ソースプレートを準備します。 384ウェルV底マイクロプレートでは、二重標的濃度の各生体分子溶液で2回印字バッファの同等のボリュームを兼ね備えています。 注：配列要素の他のタイプの標的濃度は、ヒドロゲルおよび生物学的機能の保持に依存して変化しながら、最も一般的なECMタンパク質のための適切な標的濃度は、250μgの/ mLです。各ウェルの総容積はすることができます5μL程度の低い以上15μLである必要はありません。関心対象の生体分子の組み合わせに加えて、下流の画像解析を容易にするために配列された蛍光マーカーを含みます。ローダミン結合デキストラン（2.5 mg / mlで）を使用します。 気泡を発生しないように注意しながら、ピペッティングにより完全に各ウェルを混ぜます。 100×gで1分間の供給源マイクロプレートを遠心します。ソースプレートと同じ日に調製し、マイクロアレイの製造まで4℃で保存を使用してマイクロアレイを製作。 各マイクロアレイの製造ランの前に、製造業者の指示に従ってクリーンピン。マイクロアレイのプリントヘッドに直接クリーンピンをロードします。 メーカーのソフトウェアを使用してマイクロアレイヤーやプログラムを準備します。以下の手順は、ここで使用される特定のマイクロアレイに部分的に固有のものですが、ほとんどmicroarrayersの動作も同様です。 加湿ユニットの電源を入れ、65％RH（非にセットポイントを調整）-condensing、およびレオメーターがセットポイントと一致するまで待ちます。適切なアダプタでソースプレートを置きます。 15分間、50℃でハイドロゲル基材を脱水し、適切なアダプタに配置します。マイクロアレイは、顕微鏡スライドおよびマイクロプレートの両方のためのアダプタを持っています。 35ミリメートルのガラスボトムペトリ皿を並べるために、6ウェルマイクロプレートに料理をロードしてアレイヤー上のマイクロプレートアダプタにマイクロプレートを置きます。 正確にソースプレート、アレイ設計、及び所望のフォーマット（35ミリメートルペトリ皿を含む例えば 、顕微鏡スライドまたはマイクロプレート）のレイアウトを反映するために、プログラムのパラメータを調整します。キャリーオーバーと交差汚染を防止するために、各条件間の両方の水とジメチルスルホキシド（DMSO）を使用して洗浄工程を含んで。 湿度が65％RH（結露しないこと）以下に低下していない一時間に一度以上とピンが詰まっていないことはそれほど頻繁にチェックしないと、アレイの製造を開始します。 HUMI場合dityは、加湿器を記入し、結露の関連チューブをクリアするために配列し、一時停止、予想外に低下しました。ピンが詰まっている場合は、ピンを清掃またはその他の予備洗浄ピンに置き換える並べ一時停止します。 （ すなわち 、4時間一晩に）十分な乾燥時間を提供し、同一基板上に生体分子を順次配列複数の種類にそれが可能であることに注意してください。 プログラムが完了すると、室温でのアルミ箔と65％RH（結露しないこと）一晩で覆われたスライドボックスまたはマイクロプレートに製造された配列を配置します。一般的なタンパク質の汚れや免疫蛍光を使用してアレイの品質と保持を評価する必要があるかもしれないことに注意してください。 Brafman らを参照してください。詳細は、25のため。 3.細胞培養およびアッセイ読み出し製造の翌日、4チャンバーディッシュ（顕微鏡スライド）または6ウェルマイクロプレート（ペトリ皿）に配列された基板を配置し、1％浸しますPBSで（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシン。料理のためのスライドの4 mLおよび3 mLのを使用しています。 30分間UV Cに公開します。交換ペニシリン/細胞培養培地のためのストレプトマイシン溶液。 収集した細胞を数えます。 2×10 6細胞/顕微鏡スライドあたり4 mLおよび35ミリメートルのペトリ皿当たり3 mLの配列- 500×10 3でのアレイ上にシード。 24時間またはよく人口の細胞の島が形成されるまで- 2のためのCO 2、37℃で、5％の配列培養をインキュベートします。あなたの細胞や特定のアプリケーションの必要に応じて播種密度と時間の両方を調整します。 Underseeding（ すなわち 、低密度または播種時間）が悪いのアレイ人口とスキュー生物学的な結果をもたらす可能性があります。 （ すなわち 、高密度または播種時）Overseedingすることは、島の剥離に減少し、アレイの整合性をもたらすことができます。 細胞アイランドの形成を可能にした後、予め温めた細胞培養培地で二回アレイ培養物を洗浄します。再びスライドや料理のための3 mLを4 mLのを使用しています。 OptionaLLY生物系への関心の適切なコントロールや治療（ 例えば 、小分子阻害剤、成長因子など ）を追加します。いずれかの治療の濃度を維持するために、2日間 – アレイごとに1のメディアを変更します。配列培養を開始する5日 – – 1内のTFMによって免疫蛍光または細胞 – 基質相互作用によって細胞マーカー発現および細胞機能を評価オプション1および以下のオプション2を参照してください。 オプション1：エンドポイント免疫蛍光を実行します。いくつかのタンパク質の免疫蛍光は、メタノール、エタノール、又はHClを使用して、より厳格な透過性を必要とするかもしれないことに注意してください。配列に対する潜在的な損傷に、より大規模な実験に使用する前に、各透過性プロトコルを評価し、最適化します。 吸引し、細胞培養培地4チャンバーディッシュ中のアレイスライドから、PBS中に新たに調製した4％（v / v）のパラホルムアルデヒド（PFA）の4ミリリットル/スライドを追加します。室温で15分間インキュベートします。 注意：エクスポズPFAへのUREは急性毒性をもたらすことができるし、また、接触時に皮膚を刺激または腐食することができます。保護手袋、衣服、目の保護具を着用し、化学ドラフト内でのみ使用します。 吸引しPFA溶液およびPBSの4 mLで各スライドを3回洗浄します。この時点で、固定されたスライドを1週間4℃で保存することができます。これは、アレイの整合性を確保するために免疫標識し、固定と同じ日にマウントを介して継続する、しかし、賢明です。 吸引し、PBS、PBS中のトリトンX-100 V 0.25％V / 4mLの/スライドを追加します。室温で10分間インキュベートします。 吸引除去トリトンX-100溶液とPBSの4 mLで各スライドを3回洗浄します。 PBS中の二次抗体（ロバ二次抗体について、例えば 、ロバ血清）の種にマッチし、5％（v / v）の血清を4mL /スライドを追加し、室温で1時間インキュベートします。 徹底的に各スライドからのブロッキング溶液を除去します。 PBS中の5％（v / v）の血清中に希釈した一次抗体を500μL/スライドを追加します。。このボリュームは4℃の室温で両方1時間、インキュベーションのための配列だけでなく、一晩のインキュベーションをカバーするのに十分です。 PBSの4 mLで各アレイスライドを3回洗浄します。徹底的に最終洗浄を除去し、PBS中の5％（v / v）の血清で希釈した適切な二次抗体を500μL/スライドを追加します。 PBSの4 mLで各アレイスライドを3回洗浄します。慎重にピンセットを用いて、溶液からのアレイスライドを削除する前の dH 2 Oで簡単に洗います。吸い上げるために実験室の組織を使用するか、乾燥残留のdH 2 O 視覚的に配列全体の完全なカバレッジを確認しながら、スライド全体にDAPIでソリューションを実装するピペットで100μL。 マウントするスライドの上に22×60ミリメートルのカバーガラスを配置します。明確なマニキュアでカバースリップの端をシールします。なし以前の翌日よりイメージングまで4℃、暗所で保管してください。 マイクロアレイスキャナーや倒立蛍光顕微鏡equippのいずれかを使用して、画像全体の配列ロボットステージとエド。マイクロアレイスキャナは、より迅速な読み出しを提供するが、Cy3-またはCy5と互換性の蛍光団を必要とする場合があり、単一セルの順序で、多くの場合、限られた解像度の（ すなわち 、1から10ミクロン）。蛍光顕微鏡は、蛍光チャネルの多様性を使用するためのオプションとより高い解像度（<1μmで、〜100×総合倍率）を提供するが、ロボットステージの品質及び倍率/目的に応じ遅い読み出しを提供します。 保存（ 例えば 、JPG）他のファイル形式に関連付けられたデータ圧縮または損失を防止するために、TIFFファイルなどの方法のいずれかから配列全体のイメージを捕獲しました。 オプション2：TFMを使用して、細胞 – 基質相互作用のライブ評価を行います。 TFM中の基質から細胞を解離するためにPBS中の1％（v / v）のウシ血清アルブミン（BSA）の溶液および1％（v / v）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を準備します。 に配列培養を含む35ミリメートルペトリ皿を移動しますインキュベーション（37℃、5％CO 2）、TFM測定用ロボットステージと倒立蛍光顕微鏡。 一皿では、位置をマーク（X座標、Y座標）と、位相差顕微鏡を使用して、個々の細胞の島の面を（Z座標）注目します。 ビーズを可視化するために遠赤色蛍光顕微鏡に切り替えます。前の手順で保存した各位置に戻り、セルの島下のビーズの第1層のみにフォーカスがあるように、焦点面のZ座標修正。新しい座標を保存して、前の解離相コントラストと遠赤色蛍光画像をキャプチャするために、すべてのセルの島の自動画像に進みます。 慎重に皿にBSA / SDS溶液150μLを追加し、基板からの完全な細胞解離を可能にするために5分を待ちます。位相差顕微鏡を用いて細胞分離を監視します。 細胞アイランドが基板から分離された後、tに戻ります彼はポジションをマークし、ビーズの第1の層が焦点に残っていることを確認してください。これらのビーズは、面外による細胞生成トラクションによる変形にある場合、それらは焦点に再びなるように、焦点面のZ座標を補正します。補正後のZ座標を保存し、後の解離遠赤色蛍光画像をキャプチャするためにすべての島の自動画像を繰り返します。 残りの料理のための3.5.4 – を繰り返して、3.5.1をステップ実行します。 データの4.解析免疫蛍光データの分析。 このプロセスは、アレイの画像を取得しました。 （ すなわち 、赤、青、または緑）は、個々のチャネルを含むファイルに複合アレイの画像を分割し、8ビットのTIFF画像43、44に変換します。 〜チャンネルあたり32メガピクセルはentiの下流の単一細胞分析中にメモリ要求量を減らすために画像サイズを縮小するビニング（ 例えば 、2×2または4×4）を適用しますアレイ画像を再。これらの配列の処理ステップのImageJのマクロ実装は、「array_processing.ijm」というタイトルの補足コードファイルを参照してください。 左上、左下、右下のローダミン結合デキストランマーカーまたは配列された条件の各画素の座標に注意してください。特定の配列された条件で単一細胞分析からの出力に注釈を付けるために、後で、完全に垂直であるとする8ビットのTIFF画像を回転させるために、これらの座標を使用してください。回転と手順をグリッド化これらの配列の実装のための補足コードファイルと題した「rb_array_rotater.ijm "、" rg_array_rotater.ijm "、" rgb_array_rotater.ijm」、および「array_gridding.ijm」を参照してください。 IdentifyPrimaryObjects、IdentifySecondaryObjects、およびMeasureObjectIntensity：ビン化の単一細胞分析を行い、以下のモジュールを使用してCellProfiler（バージョン2.1.1）45で8ビットのTIFF画像を回転させます。 IdentifyPrimaryObjectsはIdentifySecond、核を識別するaryObjectsは、それぞれの細胞核に関連したimmunolabelsを識別し、MeasureObjectIntensityは核ラベルとimmunolabelsの両方のための数量化を提供します。 ExportToSpreadsheetモジュールを使用してチャネルによってCSVファイルとしてすべての3つのモジュールの出力の単一セルデータは、後で下流の分析を容易にします。赤、緑、または青のチャンネルを含む画像セットのためにこれらのステップを実施CellProfilerパイプラインのために補足コードファイルと題した「b_array_image_analysis.cppipe "、" gb_array_image_analysis.cppipe "、" rb_array_image_analysis.cppipe」、および「rgb_array_image_analysis.cppipe」を参照してください。 実験のばらつきや非ガウス単一細胞の分布を説明するためにデータを変換するために、生物学的複製46により分位正規化を適用します。このプロセスは、反復間で共有さ分布を生成し、免疫標識強度の変化の公平な比較を可能にします。また、UNLIKE Zスコアと他のパラメトリック法、クォンタイル規格化は、ノンパラメトリックであり、アレイ状の条件の関数としての単一細胞の挙動のより代表的な分析を可能にする、データの特定の分布を負いません。 データをプロットし、解釈します。生物学的システムとの仮説に応じて、計算し、各アレイの条件については、次のアンサンブル対策の一つまたは複数をプロットします。 実験の過程にわたって密着性および生存の組み合わせ尺度として島ごとの細胞を計算し、プロット。 細胞の運命や機能の尺度としての変位値、正規化された免疫標識の強度を計算し、プロットします。 一貫性のある閾値以上の強度によって決定されるように通常2 SDネガティブコントロールの平均強度の上、免疫標識のための陽性細胞の割合を計算し、プロットします。 単一細胞の挙動を検討し、分類するために、免疫標識強度の代わりに、プロットの分布配列された状態の関数として。これらの分布は、中央傾向（平均値、中央値、モード）及び変動（分散、変動係数、ファノ因子）などコルモゴロフ – スミルノフ検定等の仮説検定法の測定を使用して特徴付けることができます。 TFMデータの分析。ここバトラーらが以前に開発したアルゴリズムを組み込む方法を説明されています。そして、Wang ら。 40、47。 バッチにはImageJを使用して、8ビットのTIFFファイルに画像を変換します。下流分析の計算コストと時間を削減するために、画素平均ビニング（ 例えば 、2×2）を適用します。 TFMのためのアルゴリズムは、主に単一細胞分析、単セルのセル基板界面と比較して島（〜17.5×10 3μm2で）大細胞-基板界面（75ミクロン2）necessiに集中しているようtatesビニングステップ。 バトラーらの以前に開発したアルゴリズムを使用して、科学的なプログラミングMATLABなどの環境およびプロセスに入力される撮像位相コントラストと遠赤色蛍光画像（プリ解離とポスト解離の両方を）。そして、Wang ら。 40、47。 セル島から離れた三つの領域を選択します。これらの領域は、画像または試料ドリフトに起因する変位を説明するために使用されます。 マイクロメートル（ 例えば 、0.454ピクセル/μm）とした画素から変換するための係数を提供し、基板のヤング率（ 例えば 、13キロパスカル）、およびポアソン比（ 例えば 、ここで説明するポリアクリルアミドゲル用0.48）。 各島について、幾何学的制約を定義するために周囲に境界線を引きます。この境界の外のすべての力がゼロにされています。この制約システムは、大規模なDISTA与えられた合理的ですNCE島の間（ すなわち 、450ミクロン）。 各島のための二乗平均平方根トラクションストレスと収縮モーメントを計算します。収縮モーメントは、細胞島を横切る残留応力の尺度であり、細胞-細胞相互作用48の強度を反映することが示されています。各アレイの条件については、複数のアイランドでの平均二乗平均平方根値および生物学的複製と仮説検定のための関連する分散を計算します。 例えば 、幾何学の関数として両方の対策の代表的な地図を提供するために多くの島の上のストレスやモーメントの分布を平均化するために、島の中心からの距離が可能です。