Método del agitador magnético para la detección de<em> Trichinella</em> Las larvas en muestras de músculo

1. Preparativos Coleccion de muestra Nota: El método agitador magnético se puede utilizar para muestras de músculo individuales o agrupados. Recoger muestras de los sitios de predilección apropiados y en una cantidad apropiada 9. Consulte los requisitos del país o de las recomendaciones de las TIC, la OIE o ISO. Para la Unión Europea, por ejemplo, tomar una muestra de 1 g de un pilar del diafragma en la transición hacia la parte tendinosa de los cerdos domésticos. Asegúrese de que todas las muestras de músculo están libres de toda la grasa y la fascia. Si la lengua se prueba, retirar la capa superficial antes de la prueba. Tenga cuidado si se congelan las muestras, ya que la mayoría larvas de Trichinella no se congele resistentes y desenrollar después de la muerte, son menos resistentes a la digestión y tienden a pegarse a las paredes del recipiente, lo que disminuyó la sensibilidad del ensayo. Nota: Si se congela, el doble del tamaño de la muestra en leste y aumentar el tiempo de sedimentación (ver abajo). Preparación de la solución de digestión Añadir 25% de HCl (16 ± 0,5 ml) a 2 L de agua del grifo precalentado a 46-48 ° C en un vaso de vidrio de 3 l. Demasiado bajo una temperatura de resultados en la digestión incompleta; demasiado alto de una temperatura desactiva las propiedades enzimáticas de la pepsina. Colocar una varilla de agitación en el vaso de precipitados, y se agita la solución en un plato precalentado (46-48 ° C). Añadir 10 ± 0,2 g de pepsina (1: 10.000 NF, 1: 12.500 BP, 2.000 FIP) a la solución ácida. Nota: La calidad de la pepsina es de la actividad enzimática máxima importancia y deben ser certificados por el productor. Por razones de seguridad del laboratorio y para mantener la actividad de la pepsina, la secuencia de adición de los componentes de la solución de digestión se debe respetar. Preparación de la muestra del músculo Picar hasta 100 g de muestras de músculo en una licuadora o molinillo. Para facilitar Blending, añadir 2 ml de agua precalentada a las muestras y se mezclan a velocidad máxima durante 2 – 3 s. Antes de la segunda mezcla, abrir la licuadora y transferir cualquier muestra de músculo en la parte superior del margen del borde tazón de fusión a la parte inferior y la repetición de mezcla. Continuar mezclando con ráfagas de 2 – 3 s hasta que no haya fragmentos visibles de carne se mantienen. Nota: Demasiado poco de mezcla puede dar lugar a una digestión incompleta, mientras que un exceso de mezcla puede dañar las larvas de Trichinella presentes en las muestras 6. 2. Procedimiento Digestión de la muestra de músculo Transferir 1 L del líquido de digestión en un cilindro. La transferencia de la carne de tierra en el vaso y difundir en el líquido de digestión con una cuchara o un tenedor. Enjuague bien el recipiente tapa de la licuadora, la cuchilla y la licuadora con 500 ml del líquido de digestión precalentado en el vaso de precipitados de 3 l. Nota: enjuague incompleto puede resultar en la pérdida de sensitivity. Cubrir el vaso con papel de aluminio y mantener una temperatura constante de 44-46 ° C y controlar con un termómetro. Agitar el líquido de digestión durante 30 min para crear un vórtice profundo sin salpicaduras hasta que las partículas de carne desaparecen. Dependiendo del tipo de carne probado (por ejemplo, carne de animales salvajes), aumentar el tiempo de digestión hasta un máximo de 60 min. La filtración y sedimentación del líquido de digestión Para determinar la cantidad de tejido sin digerir, ajustar la escala a cero, pesar el tamiz antes de su uso, y tenga en cuenta su peso. El tamiz debe estar limpia y libre de cualquier partículas de tejido, lo que podría dificultar las larvas de Trichinella llegar al embudo de separación. Compruebe que el embudo de separación está nivelado verticalmente. Después de la digestión, con cuidado vierta el líquido de digestión a través de un tamiz de 180 micras en un embudo de vidrio de separación. La anchura de la embudo de vidrio de separación no debe be mayor que 55% de la longitud para permitir una buena sedimentación larva. Tenga cuidado para evitar cualquier desbordamiento. Para evitar la pérdida de la sensibilidad, enjuague bien el vaso de vidrio y el tamiz con aproximadamente 200 ml de agua del grifo de una botella de lavado de aterrizaje y trasladar el agua de enjuague al embudo de vidrio sedimentación. Tenga cuidado de enjuagar cuidadosamente los bordes del vaso de precipitados de 3 l. Levantar el tamiz y enjuague el área bajo el tamiz de fondo. Determinación de la cantidad de tejido sin digerir Nota: debido a errores en la ejecución del método, el tejido muscular puede permanecer en el tamiz, como fascia bien y el tejido conectivo que son indigeribles. La cantidad de tejido no digerido se determina durante la primera etapa de sedimentación 10 min (ver 2.5). Esto permite aproximadamente 30 min para el tamiz se seque, ya que el agua residual puede influir en el peso determinado del tejido no digerido. Coloque una toalla de papel en una escala, y pesar el tamiz con los undigestejidos TED. Restar el peso del tamiz antes de la filtración a partir del peso del tamiz con tejidos no digeridos. El proceso de digestión se considera satisfactorio si no más de 5% del peso de la muestra de partida permanece en el tamiz (es decir, 5 g / 100 g de material de partida). Si la cantidad de tejido no digerido es superior al 5%, repita la prueba con muestras de músculo fresco. Si el tejido restante se compone predominantemente de tejido muscular sin digerir y muestras frescas no están disponibles, digerir los restos no digeridos de nuevo y examinar además de las muestras originales. La sedimentación del líquido de digestión Mantener el líquido de digestión se filtró en el embudo de separación durante 30 minutos. Si se deja sin tocar, las larvas de Trichinella se depositan en el fondo del embudo. Si se utilizan muestras congeladas, aumentar el tiempo de sedimentación a un máximo de 60 min. Una vez que se haya completado la sedimentación, abra completamente la llave de pasodel embudo de separación para permitir que al menos 40 ml de líquido de digestión rápida escorrentía en un vaso de precipitados (80 ml si las muestras musculares habían sido previamente congelado). En primer lugar, dejar que un medio del fluido en el cilindro y abra completamente la llave de paso en la dirección opuesta para permitir que 10 ml de líquido de digestión a pasar. Por último, abrir la llave de paso en la dirección opuesta por otros 10 mL. Este procedimiento garantiza que las larvas de Trichinella no se encuentran atrapados en la llave de paso. Nota: Se necesita una velocidad suficiente para evitar las larvas que queda en el embudo de separación, la disminución de la sensibilidad. La sedimentación de el líquido de digestión en el cilindro Deja el sedimento en el cilindro durante 10 minutos para permitir que las larvas a los sedimentos. Eliminar 30 ml de sobrenadante por aspiración con una pipeta sin perturbar el sedimento 10 ml. Para reducir la cantidad de fibras de tejido en la muestra, añadir 30 ml de agua corriente en el sedimento y se deja durante otros 10 men. Repita hasta que el líquido es claro. Aspirar el sobrenadante y transferir los 10 ml de sedimento se lavó con una placa de Petri cuadriculada o cubeta para el cómputo de larvas. Enjuague el cilindro con 10 ml de agua corriente y luego añadir el agua a la muestra. Nota: Como grandes cantidades de escombros en la muestra pueden prevenir la identificación de las larvas Trichinella (Figura 1), etapas adicionales de lavado deben ser realizadas, si es necesario. Examinación microscópica Use un triquinoscopio o un estereomicroscopio con una fuente de luz transmitida subetapa de intensidad regulable a un aumento de 15 a 20 veces para examinar las muestras inmediatamente después de las etapas de lavado. Después de verter la muestra en la placa de Petri cuadriculada, examinar el plato / cuenca sistemáticamente red por la red. Si no se encuentran estructuras sospechosas, mueva suavemente el líquido en la placa de Petri cuadriculada o con cubeta para el cómputo de larvas en forma circular para permitir que cualquier La TrichinellaRVAE, que fueron potencialmente alto, se acumule en el centro de la placa de Petri. Repetir el examen. Si se encuentra una estructura sospechoso, aumentar la ampliación a 40 – 100X. Retire las larvas de Trichinella del plato / recipiente con una pipeta y recoger en un tubo con 90% de etanol. Después de que el plato completo ha sido examinado, repetir el procedimiento, a partir de la agitación suave de la cápsula / cuenca. Repetir el procedimiento al menos tres veces o hasta que ya no se encuentran larvas. Contar el número de larvas. Correlacionar con la cantidad de tejido muscular a prueba y se presentan como larvas por gramo de petróleo (GLP). Si demasiadas larvas están presentes en el líquido de digestión para determinar el número de larvas de forma fiable, devolver el fluido que contiene las larvas al cilindro de medición, enjuague con agua del grifo de una botella de lavado de aterrizaje, y dejar que las larvas se depositan en el fondo. Después de un tiempo de sedimentación 10 min, reducir el sobrenadante a un volumen definido (por ejemplo,10 ml). Para determinar el volumen exacto, transferir el sobrenadante a un nuevo cilindro con una pipeta. Suspender las larvas de forma homogénea en el líquido por agitación vigorosa. Durante el movimiento de agitación, añadir 12 gotas de suspensión de larvas 20 l en una placa de Petri. Examine cada gota a microscopio. Determinar el número de larvas en 240 l y borrar la cuenta más alta y la más baja. Extrapolar el número de larvas al volumen total (por ejemplo, 10 ml) de sobrenadante. Nota: La calidad de la estereomicroscopio es de suma importancia para la identificación de larvas de Trichinella. Cuando las larvas se recoge en un tubo con una pipeta, comprobar cuidadosamente que las larvas no se pegó en la pared de la pipeta, pero se transfieren al tubo. Nota: Trichinella resultados positivos de muestras combinadas deben ser rastreados desde la piscina a la canal de origen. En este caso, el tamaño de la piscina se debe disminuir progresivamente hasta que la carcasa es positivo idenficados. El tamaño de la muestra también se puede aumentar durante este proceso para aumentar la sensibilidad. Cuando el examen de una muestra colectiva dé un resultado positivo o dudoso, una nueva muestra de 20 g se toma de cada cerdo. Las muestras de 20 g de cinco cerdos se reúnen y se examinaron usando el método descrito. De esta forma se examinarán muestras de 20 grupos de cinco cerdos. Cuando se detecta presencia de triquinas en un grupo de muestras de cinco cerdos, 20 g de muestras se recogen de los cerdos individuales en el grupo y se examinaron por separado hasta que se detecta la canal positivo de origen.