Metodo dell'agitatore magnetico per la rilevazione di<em> Trichinella</em> Le larve in campioni di muscolo

1. preparati raccolta dei campioni Nota: Il metodo agitatore magnetico può essere utilizzato per i campioni muscolari singole o in pool. Raccogliere campioni dai siti di predilezione appropriati e in una quantità appropriata 9. Fare riferimento ai requisiti nazionali o alle raccomandazioni del TIC, UIE o ISO. Per l'Unione europea, ad esempio, prendere un campione di 1 g da un pilastro del diaframma nella zona di transizione verso la parte tendinea dei suini domestici. Assicurarsi che tutti i campioni muscolari sono privi di tutto il grasso e fascia. Se la lingua è testato, rimuovere lo strato superficiale prima del test. Fare attenzione se i campioni sono congelati, come la maggior parte delle larve di Trichinella non sono congelare resistente e Srotolare dopo la morte, sono meno resistenti alla digestione e tendono ad aderire alle pareti del contenitore, con conseguente diminuzione della sensibilità del test. Nota: Se congelato, raddoppiare la dimensione del campione a Lest e aumentare il tempo di sedimentazione (vedi sotto). Preparazione di liquido di digestione Aggiungere 25% HCl (16 ± 0,5 mL) per 2 L di acqua di rubinetto preriscaldato a 46 – 48 ° C in un bicchiere di vetro 3 L. Troppo basso di un risultato di temperatura in incompleta digestione; troppo elevato di temperatura disattiva le proprietà enzimatiche della pepsina. Inserire una barra di agitazione nel becher, e agitare la soluzione su una piastra preriscaldata (46 – 48 ° C). Aggiungere 10 ± 0,2 g di pepsina (1: 10.000 NF, 1: 12.500 BP, 2.000 FIP) alla soluzione acida. Nota: La qualità della pepsina è della massima importanza e l'attività enzimatica devono essere certificati dal produttore. Per motivi di sicurezza di laboratorio e per mantenere l'attività della pepsina, la sequenza di aggiunta componenti fluidi digestione deve essere rispettata. Preparazione del campione muscolare Tritare fino a 100 g di campioni di muscolo in un frullatore o macinino. Per facilitare blending, aggiungere 2 ml preriscaldata acqua per i campioni e si fondono alla massima velocità per 2 – 3 s. Prima della seconda fusione, aprire il frullatore e trasferire qualsiasi campione di muscolo in cima miscelazione ciotola margine del bordo di fondo e ripetere la miscelazione. Continuare la miscelazione con esplosioni di 2 – 3 s fino a quando non frammenti visibili di carne rimangono. Nota: Troppo poco miscelazione può causare digestione incompleta, mentre troppa fusione può danneggiare il Trichinella larve presenti nei campioni 6. 2. procedura Muscle campione digestione Trasferire 1 L del fluido di digestione in un cilindro. Trasferire la carne macinata nel becher e diffondere nel fluido di digestione con un cucchiaio o forchetta. Sciacquare la ciotola coperchio frullatore, lama e frullatore con 500 ml di succo di digestione preriscaldato nel 3 L bicchiere. Nota: risciacquo incompleta può comportare la perdita di sensitivity. Coprire il becher con foglio di alluminio e mantenere una temperatura costante 44 – 46 ° C e controllare con un termometro. Mescolare il succo di digestione per 30 minuti per creare un vortice profondo senza spruzzi fino a quando le particelle di carne scompaiono. A seconda del tipo di carne provati (per esempio carne di animali selvatici), aumentare il tempo di digestione fino ad un massimo di 60 min. Filtrazione e sedimentazione del fluido di digestione Per determinare la quantità di tessuto non digerito, regolare la scala a zero, pesare il setaccio prima dell'uso, e annotare il suo peso. Il setaccio deve essere pulita e priva di eventuali particelle di tessuto, che potrebbero ostacolare le larve di Trichinella raggiungere l'imbuto di sedimentazione. Controllare che l'imbuto di separazione è livellato in senso verticale. Dopo la digestione, con attenzione versare il liquido di digestione attraverso un setaccio di 180 micron in un imbuto di vetro di separazione. La larghezza del imbuto di vetro di separazione non deve be più grande di 55% della lunghezza per consentire una buona larva sedimentazione. Fare attenzione per evitare qualsiasi troppo pieno. Per evitare la perdita di sensibilità, sciacquare il bicchiere di vetro e il setaccio con circa 200 ml di acqua di rubinetto da una bottiglia di lavaggio squeeze e trasferire l'acqua di risciacquo nell'imbuto bicchiere sedimentazione. Fare attenzione a lavare con cura i bordi del 3 L bicchiere. Sollevare il setaccio e lavare l'area sotto il setaccio accuratamente. Determinazione della quantità di tessuto non digerito Nota: A causa di errori nella esecuzione del metodo, tessuto muscolare può rimanere sul setaccio, nonché fascia e tessuto connettivo che sono indigeribili. La quantità di tessuto non digerito è determinato durante la prima fase di sedimentazione 10 min (vedere 2.5). Questo permette circa 30 minuti per il setaccio a secco, come l'acqua residua può influenzare il peso determinato del tessuto non digerito. Mettere un tovagliolo di carta su una scala, e pesare il setaccio con le undigestessuti TED. Sottrarre il peso del setaccio prima della filtrazione dal peso del setaccio con i tessuti non digerite. Il processo di digestione è considerato soddisfacente se non più del 5% del peso del campione iniziale rimane sul setaccio (cioè 5 g / 100 g materiale di partenza). Se la quantità di tessuto non digerito supera il 5%, ripetere il test utilizzando campioni di muscolo freschi. Se il tessuto rimanente è prevalentemente costituito da tessuto muscolare non digerito e campioni freschi non sono disponibili, digerire ancora i resti non digeriti ed esaminare in aggiunta ai campioni originali. La sedimentazione del fluido di digestione Mantenere il fluido di digestione filtrato nell'imbuto separatore per 30 min. Se lasciati indisturbati, le larve Trichinella si depositerà sul fondo dell'imbuto. Se si utilizzano campioni congelati, aumentare il tempo di sedimentazione a un massimo di 60 min. Una volta che la sedimentazione è completa, aprire completamente il rubinettodell'imbuto separatore di lasciare almeno 40 ml di succo di digestione rapidamente in un recipiente cilindrico (80 mL se campioni di muscolo erano stati precedentemente congelati). Per prima cosa, la metà del fluido nel cilindro e quindi aprire completamente il rubinetto nella direzione opposta per consentire 10 ml di succo di digestione per passare. Infine, aprire il rubinetto in senso opposto per altri 10 mL. Questa procedura garantisce che larve di Trichinella non sono intrappolati nel rubinetto. Nota: è necessaria la velocità sufficiente per evitare le larve che rimane nella imbuto separatore, diminuendo la sensibilità. La sedimentazione del fluido di digestione nel cilindro Lasciare il sedimento nel cilindro per 10 minuti per permettere alle larve di sedimenti. Rimuovere 30 mL surnatante mediante aspirazione con una pipetta senza disturbare il sedimento 10 mL. Per ridurre la quantità di fibre di tessuto nel campione, aggiungere 30 ml di acqua di rubinetto per il sedimento e lasciar riposare per altri 10 ma. Ripetere fino a quando il liquido è chiaro. Rimuovere il surnatante e trasferire i 10 ml lavato sedimenti di una capsula di Petri a griglia o vaschetta per il conteggio delle larve. Lavare il cilindro con 10 mL di acqua di rubinetto e quindi aggiungere l'acqua al campione. Nota: Come grandi quantità di detriti nel campione possono impedire l'identificazione delle larve Trichinella (Figura 1), ulteriori fasi di lavaggio devono essere eseguite, se necessario. Esame microscopico Utilizzare trichinoscopio o stereomicroscopio con una sorgente luminosa sottostadio trasmessa di intensità regolabile da 15 a 20 ingrandimenti per esaminare i campioni immediatamente dopo le fasi di lavaggio. Dopo aver versato il campione nella capsula di Petri con griglia, esaminare il piatto / bacino sistematicamente griglia per griglia. Se non si trovano le strutture sospette, spostare delicatamente il liquido nella scatola di Petri con griglia o vaschetta per il conteggio delle larve in modo circolare per consentire a qualsiasi Trichinella larvae, che sono stati potenzialmente trascurato, si accumuli nel centro del piatto Petri. Ripetere l'esame. Se viene trovata una struttura di sospetto, aumentare l'ingrandimento di 40 – 100X. Rimuovere larve di Trichinella dal piatto / vasca con una pipetta e raccogliere in un tubo con etanolo al 90%. Dopo il piatto completo è stato esaminato, ripetere la procedura partendo dal leggero scuotimento del piatto / bacino. Ripetere la procedura almeno tre volte o fino a quando non più larve si trovano. Contare il numero di larve. Correlare alla quantità di tessuto muscolare testati e presente come larve per grammo (GPL). Se troppe le larve sono presenti nel succo di digestione per determinare il numero delle larve in modo affidabile, restituire il fluido contenente le larve al cilindro di misura, sciacquare con acqua di rubinetto da una bottiglia di lavaggio di compressione, e lasciare le larve di depositarsi sul fondo. Dopo un tempo di sedimentazione 10 min, ridurre il supernatante in un volume definito (ad esempio10 mL). Per determinare il volume esatto, trasferire il surnatante in un nuovo cilindro con una pipetta. Sospendere larve omogeneamente nel fluido da agitazione vigorosa. Durante il movimento di agitazione, aggiungere 12 gocce di 20 microlitri di sospensione delle larve su una capsula di Petri. Esaminate ogni goccia al microscopio. Determinare il numero di larve in 240 ml ed eliminare il più alto e il più basso conteggio. Estrapolare il numero di larve al volume totale (ad esempio 10 ml) del surnatante. Nota: La qualità della stereomicroscopio è di fondamentale importanza per l'identificazione di larve di Trichinella. Quando le larve sono raccolti in un tubo da una pipetta, verificare attentamente che le larve non ha attaccato sulla parete pipetta, ma vengono trasferiti al tubo. Nota: Trichinella Positive risultati di campioni aggregati devono essere ricondotte dalla piscina alla carcassa di origine. Qui, la dimensione del pool dovrebbe progressivamente diminuire fino a quando la carcassa positivo è identificata. La dimensione del campione può essere aumentata durante questo processo per aumentare la sensibilità. Se l'esame di un campione aggregato produce un risultato positivo o incerto, un ulteriore campione di 20 g è preso da ciascun suino. I 20 g di campioni provenienti da cinque suini vengono raggruppati ed esaminati con il metodo descritto. In questo modo saranno esaminati campioni provenienti da 20 gruppi di cinque suini. Quando viene rilevato Trichinella in un campione composito da cinque suini, campioni di 20 g vengono raccolti dai singoli suini del gruppo e ciascuno viene esaminato separatamente fino a quando viene rilevata la carcassa positiva di origine.