Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом побратимов гистонов

Эукариотической ДНК плотно упакована в ядрах клеток в хроматин. Фундаментальным строительным блоком хроматина является нуклеосомная ядро ​​частицы, которая содержит ~ 147 п.н. ДНК, обернутой вокруг октамерной комплекса, состоящего из двух экземплярах, каждый из четырех основных гистонов (Н3, Н4, H2A, H2B). Гистонов белки питают множество посттрансляционных модификаций (PTMs). Эти ковалентные замены вызывают изменения в структуре хроматина, как непосредственно влияет на физическую химию системы , так и косвенно за счет привлечения хроматина ремоделирования деятельности ^{1, 2, 3.} К этим средствам, гистонов PTMs контролировать доступность хроматина и, следовательно, регулировать все ДНК на основе клеточных функций ^4.

PTMs устанавливаются гистонов модифицирующие ферментных систем в основном на неструктурированных N-концевых сегментов (хвостов) нуклеосом внедренной основной гистоуказанные в другом месте. Из – за многих модификаций участков на относительно короткой последовательности гистонов, PTMs влияют друг на друга за счет индукции или блокирования последующих реакций в модификации, эффект , известный как модификация перекрестных помех ^5. Из-за общей симметричной архитектуры нуклеосомой, были мысли модификации реакции и механизмы перекрестных помех происходит аналогичным образом на двух копий каждого нуклеосомной гистона (сестра гистонов). Эта концепция была недавно оспорена и впоследствии опровергнуты. В частности, в пробирке ферментативные анализы на свободный гистонов H3 хвостовых пептидов и на нуклеосом показали , что множество Н3 киназ введена фосфорилирования в асимметричной форме ^6. Кроме того, аффинно очистки на основе анализа ЖХ-МС / МС показали существование асимметрично H3-метилированных нуклеосом в нескольких типах эукариотических клеток ^7. Таким образом, асимметрично модифицированные нуклеосом образуют новые виды, иинструменты необходимы, чтобы раскрыть механизмы, которые контролируют их формирование и анализ эффектов перекрестных помех, что эта асимметрия может оказывающие.

Как правило, вестерн-блоттинга (ВБ) и масс-спектрометрического анализа (МС), были использованы для обнаружения гистонов PTMs. Несмотря на легкое применение, ВБ страдает от проблем специфичности / перекрестной реактивности. Кроме того, он не способен выполнять одновременный анализ нескольких PTM и прямой количественной оценки реакций модификации ^8. С другой стороны, анализ MS использует сложное оборудование , которое требует обучения на высоком уровне, но и обеспечивает высокую специфичность, а также одновременное отображение и количественной оценки множественных PTMs ^9.   Тем не менее, оба метода разрушительный и нуклеосомной комплексы диссоциируют перед проведением анализа, что приводит к смеси гистонов и / или гистонов производных пептидов. Эта манипуляция устраняет способность различать независимыйРеакции модификации, которые происходят на каждой из двух сестринских гистонов и сообщить о копии конкретного статус модификации нуклеосомной гистонов.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) эволюционировали в качестве альтернативного метода для сопоставления реакций PTM. ЯМР без нарушения и таким образом позволяет осуществлять мониторинг событий PTM в режиме реального времени способом , в разведенной смеси, и даже в интактных клетках ^{10, 11.} Разработка процедур для быстрого сбора данных, а также для отображения с высокой разрешающей способностью на основе на 2D гетероолигомере ядерные методы корреляции меченого изотопом ⁽¹⁵ Н и / или ¹³ С) образцов ¹² позволило одновременное отображение различных типов PTMs, такие как серин / треонин / фосфорилирования тирозина, лизина ацетилирование / метилирования и аргинина метилирования ^13. В зависимости от ПТМ под следствием, ¹⁵ N- или ¹³ C-мечение прotocols могут быть использованы, чтобы отметить функциональную группу белка, который служит в качестве модифицирующей репортера. Следовательно, отображение ПТМ может быть выполнена следующим характеристическую химического сдвига смещения соответствующей функциональной группы 'воспринимая' Чередование на химическую среду. В большинстве случаев, как NH и CH химические группы могут быть использованы, чтобы сообщить эволюцию PTM интереса.

Текущий протокол описывает генерацию нуклеосом, содержащих дифференцированно меченого изотопом сестра гистоны. Она сочетает в себе гибкость ЯМР – спектроскопии для отображения PTMs , используя как ¹ Н- ¹⁵ N и ¹ Н- ¹³ корреляции спектров C с использованием различных тегов сродства белка для очистки выбранных реконструированных гистонов комплексов. Следует отметить, что протокол использует два различных пулов определенного гистона для нуклеосомнои восстановления. Эти бассейны дифференцированно меченого изотопом (один с <suр> 15 Н, а другой с ¹³ С), и они слиты с полигистидиновая и стрептавидин аффинной метки, соответственно. Тандем сродства схема очистки с Ni-NTA и стрептавидин на основе хроматографии первоначально использовалась Voigt и др. ⁷ используется для очистки асимметричный вид от симметричных аналогов (Рис . 1А) Асимметричные гистонов октамеры используются в дальнейшем для восстановления эквивалентных нуклеосомной комплексов (рис 1b), с использованием стандартной солевой метод ¹⁴ диализный. Кроме того, с помощью той же процедуры, и при наличии одного из пулов гистонов предшествующих тем редактированию, ПТМ, могут быть включены асимметрично на полученную нуклеосом. Взаимодействие этих субстратов с гистонов модифицирующих ферментов и последующего ЯМР-картирования модификации событий позволяют охарактеризовать механизмы перекрестных помех как в-цис (premodified гистонов копия) и транс (unmodifiред гистонов копия) (рис 1C).