示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成
Summary
このプロトコルは、示差的に同位体標識姉妹ヒストンを含むヌクレオソームの再構成を説明します。これと同時に、非対称的に翻訳後修飾ヌクレオソームはpremodifiedヒストンのコピーを使用した後に発生することができます。これらの製剤は、容易に高分解能NMR分光法を用いて、同時に両方の姉妹ヒストンに、修正クロストークのメカニズムを研究するために使用することができます。
Abstract
非対称的に変更されたヌクレオソームは、翻訳後修飾（PTMを）の別個のセットが飾らヒストンの2つのコピー（姉妹ヒストン）が含まれています。彼らは、新たに設立し、機能的な意味合いの未知の手段で種を同定しています。現在の分析方法は、ヌクレオソーム姉妹ヒストン上のPTMのコピー固有の発生を検出するには不十分です。このプロトコルは、示差的に同位体標識姉妹ヒストンを含むヌクレオソームのin vitro再構成のための生化学的方法を提示します。生成された複合体はまた、非対称ヒストンsubcomplexesのリフォールディング時premodifiedヒストンプールを含めた後に、変更することができます。これらの非対称のヌクレオソームの調製物は、容易に、核磁気共鳴（NMR）分光法を用いて非対称的に事前に組み込まPTMによって課さ修正クロストークのメカニズムを研究するためのヒストン修飾酵素と反応させることができます。で、特に、修飾反応リアルタイムは、それぞれの同位体の種類に合わせNMR相関実験の種類を行うことにより、2つの姉妹ヒストンに独立してマッピングすることができます。この方法論は、ヌクレオソーム複合体上の不斉PTMパターンの形成および伝播に貢献するクロストークのメカニズムを研究するための手段を提供します。
Introduction
真核生物のDNAはしっかりとクロマチンに細胞核内にパッケージされています。クロマチンの基本的なビルディングブロックは、二つのコピー4つのコアヒストン（H3、H4、H2A、H2B）のそれぞれの構成された八量複雑に巻き付けDNAの〜147塩基対が含まれているヌクレオソームコア粒子です。ヒストンタンパク質は、翻訳後修飾（PTMを）の過多を抱きます。これらの共有結合の置換は、両方の直接システムの物理化学的性質に影響することによって間接的にクロマチンリモデリング活性1、2、3を補充することによって、クロマチン構造の変化を誘導します。これらの手段によって、ヒストンのPTMは、したがって、すべてのDNAに基づく細胞機能4を調節し 、クロマチンのアクセシビリティを制御します。
PTMは、主にヌクレオソーム内蔵コアヒストの構造化されていないN末端セグメント（尾部）上のヒストン修飾酵素システムによってインストールされていますファミコン。ヒストン尾部の比較的短い配列上の多くの修飾部位に、PTMのは、誘導またはその後の修飾反応、修正クロストーク5として知られる効果をブロックすることにより、相互に影響を与えます。そのためヌクレオソームの全体的な対称アーキテクチャにより、修飾反応やクロストークメカニズムは、各ヌクレオヒストン（姉妹ヒストン）の2つのコピーにも同様に起こると考えられていました。この概念は、最近に挑戦し、その後反証ました。特に、無料のヒストンH3テールペプチド上とヌクレオソーム上のインビトロ酵素アッセイは、H3キナーゼのセットが非対称に6でリン酸化を導入することを実証しました。さらに、アフィニティー精製系のLC-MS / MS分析は、真核細胞7のいくつかのタイプの非対称H3メチル化ヌクレオソームの存在を明らかにしました。このように、非対称的に変更されたヌクレオソームは、新規種を構成し、ツールは、それらの形成を制御するメカニズムを明らかにし、この非対称性を発揮する可能性があるクロストークの影響を分析するために必要とされます。
一般に、ウェスタンブロット（WB）および質量分析（MS）分析は、ヒストンのPTMを検出するために使用されてきました。その簡単なアプリケーションにもかかわらず、WBは、特異性/交差反応性の問題があります。その上、それは同時マルチPTM分析および修飾反応8の直接の定量化を行うことができません。一方、MS分析は、高レベルのトレーニングを必要とする高度な機器を使用するが、複数のPTM 9の同時マッピングおよび定量ならびに高い特異性を提供します。 しかし、両方の方法は破壊的であり、ヌクレオソーム複合体は、ヒストンおよび/またはヒストン由来ペプチドの混合物を生じる、分析前に分離されています。この操作は、独立し区別する能力を削除しますヌクレオヒストンのコピー特異的修飾の状況を報告するために、2つの姉妹ヒストンのそれぞれで発生し、修飾反応。
核磁気共鳴（NMR）分光法は、PTM反応をマッピングする別の方法として発展しました。 NMRは、11無停止であるため、再構成された混合物中のリアルタイムでPTMイベントの監視を可能にし、さらに完全なセル10で。同位体標識の2次元ヘテロ核相関法に基づいて、高速データ取得のためだけでなく、高解像度のマッピングのためのルーチンの開発（15 Nおよび/または13 C）試料12は、例えば、のPTMの異なるタイプの同時マッピングを可能にセリン/スレオニン/チロシンリン酸化、リジンのアセチル化/メチル化、およびアルギニンのメチル化13など。調査中のPTMに応じて、15 N-または13 C標識PRotocolsは変更レポーターとして機能するタンパク質の官能基をマークするために使用することができます。したがって、PTMマッピングは、化学的環境の変化を「感知」に対応する官能基の特徴的な化学シフトの変位に追従して行うことができます。ほとんどの場合、NHおよびCHの化学基の両方は、対象のPTMの発生を報告するために使用することができます。
現在のプロトコルは、示差同位体標識姉妹ヒストンを含むヌクレオソームの生成を説明しています。これは、NMR分光法の柔軟性が選択された再構成されたヒストン複合体の精製のための異なるタンパク質アフィニティータグを利用して両方の1 H- 15 Nと1 H- 13 C相関スペクトルを用いたPTMをマッピングするために組み合わせます。特に、プロトコルは、ヌクレオソーム再構成のための特定のヒストンの二つの異なるプールを採用しています。これらのプールは、差別的同位体標識（1であります<suP> 15 N、13 Cとその他）、これらはそれぞれ、ポリヒスチジンおよびストレプトアビジンアフィニティタグに融合されています。 Ni-NTAおよびストレプトアビジンに基づくクロマトグラフィータンデムアフィニティ精製スキームは、最初フォークトら使用します。 7は、対称の対応（ 図1A）から非対称種を精製するために使用されます。非対称ヒストン八量体は、標準的な塩透析法14を使用して、同等のヌクレオソーム複合体（ 図1B）を再構成するために、その後使用されています。さらに、同様の手順を介して、プリ修飾ヒストンプールの1つを有することによって、PTMが得ヌクレオソームに非対称的に組み込むことができます。ヒストン修飾酵素と変更イベントのその後のNMR-マッピングによるこれらの基質の反応が（両方でシス （premodifiedヒストンコピー）とでトランス unmodifiをクロストークメカニズムの特徴付けを可能にしますエドヒストンコピー）（ 図1C）。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヌクレオソーム再構成のために、現在のプロトコルは、601-Widomヌクレオソーム位置決めシーケンス20を含む165 bpの長さのDNAテンプレートを利用したが、同様の性能は、DNAテンプレートの様々な長さを使用して期待されています。プロトコルは、ヒストンH3の非対称型を使用して設計し、使用しました。同じ原理で、この方法は、他のコアのヒストンのためにも適用することが…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究助成金（LI 2402 / 2-1）を介して作業に資金を提供するための実験とドイツ学術協会（DFG）を実行するためにウェットラボスペースとインフラを提供するための作者のおかげで博士フィリップSelenko（FMP-ベルリン）。
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
References
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