כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

DNA איקריוטיים ארוז היטב בתוך גרעין התא אל הכרומטין. אבן הבניין הבסיסית של הכרומטין הוא חלקיק הליבה הנוקלאוזום המכיל ~ 147 נ"ב של DNA עטוף סביב תסביך octameric מורכב משני עותקים כל אחד מארבעת ההיסטונים הליבה (H3, H4, H2A, H2B). חלבוני היסטון נמל שפע של שלאחר translational שינויים (PTMs). החלפות קוולנטיים אלה לגרום שינויים במבנה הכרומטין, הוא באופן ישיר על ידי המשפיע על הכימיה הפיסיקלית של המערכת ובעקיפין על ידי גיוס פעילויות שיפוץ-הכרומטין ^{1, 2, 3.} באמצעות אלה, PTMs היסטון לשלוט נגישות הכרומטין, ומכאן, להסדיר את כל הפונקציות הסלולר מבוססי DNA ^4.

PTMs מותקנים על ידי מערכות אנזימים שינוי היסטון בעיקר על ערוצי N-terminal לא מובנה (זנבות) של histo הליבה-משולב הנוקלאוזוםנוס. בשל באתרי השינוי הרבים על הרצף קצר יחסית זנבות היסטון, PTMs להשפיע אחד על השני על ידי גרימה או חסימת תגובות מפני עריכה, תופעה הידועה בשם ⁵ הצטלבות שינוי. בגלל הארכיטקטורה הסימטרית הכוללת של הנוקלאוזום, תגובות שינוי ומנגנוני crosstalk נחשבו להתרחש באופן דומה על שני העותקים של כל היסטון nucleosomal (היסטונים אחות). מושג זה היה לערער לאחרונה ובהמשך להפרכה. במיוחד, במבחנת מבחני האנזימטית על פפטידים זנב H3 חינם היסטון ועל נוקלאוזום הוכיחו כי קבוצה של קינאזות H3 הציגה זירחון בתוך סימטרי באופן ^6. בנוסף, זיקת טיהור מבוססת LC-MS / MS ניתוח חשף את קיומם של סימטרית נוקלאוזום-מפוגל H3 בכמה סוגים של תאים איקריוטיים ^7. לפיכך, סימטרי נוקלאוזום שונה מהווה מיני רומן,כלים נדרשים לחשוף את המנגנונים השולטים היווצרותם ולנתח את ההשפעות crosstalk שחוסר סימטריה זה עלול להפעיל.

בדרך כלל, המערבי סופג (WB) ו ספקטרומטריית מסה (MS) ניתוח שימשו כדי לזהות PTMs היסטון. למרות היישום הקל שלה, WB סובל סגוליים / בעיות תגובתיות צולבות. נוסף על כך, זה אינו מסוגל לבצע ניתוח רב-PTM סימולטני וכימות ישירה של תגובות השינוי ^8. מצד השני, ניתוח MS מעסיק מכשור מתוחכם הדורש הכשרה ברמה גבוהה, אך מספק סגולי גבוהות כמו גם מיפוי סימולטני וכימות של מספר ⁹ PTMs.   עם זאת, שתי השיטות הן משבשות מתחמי nucleosomal הם ניתקו לפני הניתוח, והולידו תערובת של ההיסטונים ו / או פפטידים שמקורם היסטון. מניפולציה זו מסירה את היכולת להבחין עצמאיתגובות שינוי המתרחשות על כל אחד משני ההיסטונים אחותו לדווח על מצב שינוי ספציפי העותק של ההיסטונים nucleosomal.

תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה התפתחה כמו שיטה חלופית כדי למפות תגובות PTM. התמ"ג הוא הפרעה ובכך מאפשרת ניטור של אירועים PTM באופן בזמן אמת בתערובות מחדש, ואפילו תאים שלמים ^{10, 11.} הפיתוח שגר לרכישת נתונים מהירה וכן למיפוי ברזולוציה גבוהה המבוסס על 2D שיטות קורלציה הטרו-הגרעיני של שכותרתו איזוטופ ⁽¹⁵ N ו / או ¹³ ג) דגימות ¹² אפשרו המיפוי סימולטני של סוגים שונים של PTMs, כגון כמו סרין / תראונין / זירחון טירוזין, acetylation ליזין / מתילציה, ו ארגינין מתילציה ^13. בהתאם PTM תחת חקירה, ¹⁵ N- או ¹³ יח"צ C-תיוגיכול להיות מועסק otocols לסמן את הקבוצה פונקציונלי חלבון המשמש ככתב שינוי. כתוצאה מכך, מיפוי PTM יכול להתבצע על ידי ביצוע עקירת המשמרת כימית מאפיינת את הקבוצה הפונקציונלית המתאימה "חישה" השינוי על הסביבה הכימית. ברוב המקרים, הוא NH וקבוצות כימיות CH ניתן המשמשים לצורכי דיווח על האבולוציה של PTM של עניין.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. הוא משלב את הגמישות של ספקטרוסקופיה NMR למפה PTMs הן באמצעות ספקטרום קורלציה ¹ H- ¹⁵ N ו- ¹ H- ¹³ C עם ניצול של תגי קרבה חלבון שונים לטיהור של מתחמי היסטון מחדש שנבחרו. יש לציין, כי הפרוטוקול מעסיק שתי ברכות שונות של היסטון בפרט עבור כינון מחדש הנוקלאוזום. בריכות אלו הן איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי (אחד עם <sup> 15 N, השני עם ¹³ C), והם התמזגו polyhistidine ותג זיקה streptavidin, בהתאמה. ערכת טיהור זיקה טנדם עם Ni-נ.ת.ע כרומטוגרפיה מבוסס streptavidin בתחילה שמוצגת וויגט et al. ⁷ מועסק לטהר מינים סימטריים מעמיתיהם סימטריים (איור 1 א). Octamers היסטון אסימטרית משמש לאחר מכן כדי לשקם מתחמי nucleosomal שווים ערך (איור 1B), בשיטת דיאליזת המלח הרגיל ^14. בנוסף, דרך אותו ההליך ועל ידי שיש אחת הבריכות היסטון מראש שונה, PTM ניתן לשלב סימטרי על נוקלאוזום שהתקבל. התגובה של אלה מצעים עם אנזימי שינוי היסטון ו- NMR-המיפוי הבא של אירועי שינוי לאפשר אפיון מנגנוני crosstalk הוא-cis (עותק היסטון premodified) וב-טרנס (unmodifiעותק היסטון ed) (תרשים 1C).