Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon

Eukaryotische DNA is strak verpakt binnen celkernen in chromatine. De fundamentele bouwsteen van chromatine is de nucleosoom kerndeeltje dat ~ 147 bp van DNA gewikkeld rond een octamère complex bestaat uit twee exemplaren elk van de vier kern histonen (H3, H4, H2A, H2B) bevat. Histon-eiwitten haven een overvloed aan post-translationele modificaties (PTMs). Deze covalente substituties induceren veranderingen in de structuur van chromatine, zowel direct door het beïnvloeden van de fysische chemie van het systeem en indirect door het werven van chromatine remodeling activiteiten ^{1, 2, 3.} Door deze middelen, histon fosforylatie controleren chromatine toegankelijkheid en daarmee regelen alle DNA-celfuncties ^4.

PTMs worden geïnstalleerd door histon-modificerende enzymsystemen vooral op de ongestructureerde N-terminale segmenten (staarten) van nucleosomen opgenomen kern histones. Door de vele modificatieplaatsen op relatief korte sequentie van histone staarten, fosforylatie beïnvloeden elkaar door het induceren of blokkerende daaropvolgende modificatiereacties, een effect bekend als modificatie overspraak ^5. Vanwege de symmetrische algehele architectuur van de nucleosoom, modificaties en overspraak mechanismen men dacht dat eveneens plaatsvinden op de twee kopieën van elk histon nucleosomale (zuster histonen). Dit concept werd onlangs uitgedaagd en vervolgens weerlegd. In het bijzonder, in vitro enzymatische assays op vrije histon H3 staart peptiden en nucleosomen aangetoond dat een reeks H3 kinases geïntroduceerd fosforylering in een asymmetrische wijze ^6. Bovendien affiniteit-zuivering gebaseerde LC-MS / MS analyse bleek dat dit asymmetrisch H3 gemethyleerd nucleosomen in verschillende typen eukaryote cellen ^7. Aldus asymmetrisch gemodificeerde nucleosomen vormen nieuwe soorten, engereedschappen nodig om de mechanismen die de vorming ervan te regelen en het overspraak effect dat deze asymmetrie kan uitoefenen analyseren onthullen.

Gewoonlijk hebben Western blotting (WB) en massaspectrometrie analyse (MS) gebruikt om histon fosforylatie detecteren. Ondanks de eenvoudige toepassing, WB lijdt aan specificiteit / cross-reactiviteit problemen. Op de top van dat, het is niet in staat om het uitvoeren van simultane multi-PTM analyse en directe kwantificering van de wijziging reacties ^8. Anderzijds, MS analyse maakt gebruik van verfijnde instrumentatie hoog niveau training vereist, maar biedt een hoge specificiteit en gelijktijdig in kaart brengen en kwantificeren van meerdere PTMs ^9.   Beide methoden zijn storend en nucleosomale complexen zijn gedissocieerd voor de analyse, waardoor een mengsel van histonen en / of histon afgeleide peptides. Deze manipulatie verwijdert de mogelijkheid om onderscheid te maken onafhankelijkemodificatiereacties die plaatsvinden op elk van de twee zuster histonen en de kopie modificatie status van de nucleosomale histonen melden.

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopie ontwikkeld als alternatief voor PTM reacties kaart. NMR is niet-storende en aldus het toezicht PTM evenementen in een real-time wijze bereide mengsels, en ook in intacte cellen ^{10, 11.} De ontwikkeling van routines voor snelle data acquisitie en voor hoge resolutie mapping op basis van 2D hetero-nucleaire correlatie methoden isotoop gemerkte ⁽¹⁵ N en / of ¹³ C) monsters ¹² toegelaten gelijktijdige toewijzing van verschillende PTMs dergelijke als serine / threonine / tyrosine fosforylering, acetylering lysine / methylatie en arginine methylatie ^13. Afhankelijk van het doorvoermechanisme onderzochte ^{15 13} N- of C-labeling protocols kan worden toegepast om het eiwit functionele groep die als een modificatie reporter markeren. Bijgevolg kan PTM mapping worden uitgevoerd door de karakteristieke chemische verschuiving verplaatsing van de corresponderende functionele groep "sensing" de wijziging van de chemische omgeving. In de meeste gevallen, kunnen zowel NH en CH chemische groepen worden gebruikt om de ontwikkeling van het doorvoermechanisme plaats aangeven.

Het huidige protocol beschrijft de vorming van nucleosomen die differentieel-isotoop gemerkte zus histonen. Combineert de flexibiliteit van NMR-spectroscopie naar kaart PTMs met beide ¹ H- ¹⁵ N en ¹ H- ¹³ C correlatiespectra met het gebruik van verschillende eiwitten affiniteit tags voor zuivering van het geselecteerde gereconstitueerd histon complexen. Met name het protocol maakt gebruik van twee verschillende pools van een bepaald histon voor nucleosoom oplossen. Deze zwembaden zijn verschillend isotoop gemerkte (een met <sup> 15 N, de andere met ¹³ C), en worden gefuseerd met een polyhistidine- en een streptavidine tag affiniteit respectievelijk. Een tandem affiniteitszuivering regeling met Ni-NTA en streptavidine-gebaseerde chromatografie aanvankelijk gebruikt door Voigt et al. ⁷ wordt toegepast om asymmetrische species van symmetrische tegenhangers (Figuur 1A) zuiveren. Asymmetrische histon octameren worden vervolgens gebruikt om gelijkwaardige nucleosomale complexen (figuur 1B) te reconstrueren, met behulp van de standaard zout dialyse methode ^14. Bovendien, volgens dezelfde procedure en door één van de histon pools pre-gemodificeerde, een doorvoermechanisme kan asymmetrisch worden opgenomen op de resulterende nucleosomen. De reactie van deze substraten met-histon-modificerende enzymen en daarop volgende NMR-in kaart brengen van de wijziging evenementen mogelijk te maken de karakterisering van crosstalk mechanismen zowel in cis (premodified histon kopiëren) en in-trans (unmodified histon copy) (figuur 1C).