ال<em> فيفو السابقين</em> القولون ثقافة الجهاز واستخدامه في الدراسات الدفاعية المضيف مضادات الميكروبات
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
يعرض الأمعاء بنية هياكل سرداب المتكررة التي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية، propia الصفيحة التي تحتوي على الخلايا المناعية، وسدى. كل من هذه الخلايا غير متجانسة تساهم في التوازن المعوي والمشاركة في دفاع المضيف مضادات الميكروبات. لذلك، وتحديد نموذج بديل لدراسة الاستجابة المناعية والنشاط المضادة للميكروبات الأمعاء في الإعداد في المختبر هي صعبة للغاية. في الدراسات المختبرية باستخدام خلد خطوط الخلايا الظهارية في الأمعاء أو سرداب حتى الابتدائي عضي الثقافة لا تمثل علم وظائف الأعضاء الدقيق الأمعاء الطبيعي والمكروية لها. هنا، نحن نناقش طريقة لزراعة الأنسجة الماوس القولون في طبق ثقافة، وكيف يمكن تنفيذ هذا المجراة سابقا نظام الجهاز ثقافة في الدراسات المتعلقة الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات. في التجارب التمثيلية، أظهرنا أن كولون في الثقافة الجهاز تعبر عن الببتيدات المضادة للميكروبات في التنonse إلى دخيلة IL-1β و IL-18. وعلاوة على ذلك، فإن الجزيئات المستجيب المضادة للميكروبات التي تنتجها الأنسجة القولون في الثقافة الجهاز تقتل بكفاءة القولونية في المختبر. هذا النهج، وبالتالي، يمكن استخدامها لتشريح دور أنماط الجزيئية pathogen- ويرتبط خطر والمستقبلات الخلوية في تنظيم المعوية الاستجابات المناعية الفطرية والاستجابات دفاع المضيف مضادات الميكروبات.
Introduction
يمثل الأمعاء نظام ديناميكي يعمل كحاجز للالكائنات الدقيقة المتعايشة، وتحارب ضد مسببات الأمراض الغازية، وينظم تكوينه الميكروبي 1. الخلايا الظهارية في الأمعاء، ويتألف من المعوية والخلايا الكأسية، والخلايا بانيت والخلايا enteroendocrine، هي سكان الخلية الرئيسية التي توفر الردود دفاع المضيف ضد الجراثيم المعوية. الخلايا الكأسية تنتج mucins أن إنشاء منطقة منزوعة السلاح على الجزء العلوي من طبقة الطلائية 2. الخلايا بانيت والمعوية تنتج الببتيدات المضادة للميكروبات، السيتوكينات، والأكسجين والنيتروجين الأنواع المتفاعلة التي تشكل الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات والمساهمة في تشكيل وتكوين الجراثيم المعوية 3 و 4. بالإضافة إلى الخلايا الظهارية، والخلايا المناعية بما في ذلك الضامة، والخلايا الجذعية، العدلات، والخلايا القاتلة الطبيعية، الخلايا الليمفاوية، واينا الخلايا اللمفاوية الشركة المصرية للاتصالات في الصفيحة المخصوصة وتحت المخاطية تلعب دورا حاسما في الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات المعوية من خلال إنتاج السيتوكينات، كيموكينات، وغيرها من الوسطاء 5-7. من أجل فهم كيف يمكن لنظام المناعة المخاطية ينظم الجراثيم ويوفر الحماية ضد العدوى الميكروبية، فمن المهم النظر في التفاعل المعقد للسكان الخلية غير متجانسة من القناة الهضمية. ومع ذلك، وهو نموذج في المختبر الذي يشمل جميع الميزات الموجودة في الأمعاء غير متوفر. لذلك، والدراسات الجزيئية على تفاعل المضيف الممرض في الأمعاء تشكل تحديا للغاية.
على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد تم تطوير عدة أنظمة نموذج التي تحاكي جوانب الغشاء المخاطي في الأمعاء عن التحقيق في العمليات الفيزيولوجية المرضية تشارك في الأمراض الالتهابية الأمعاء (IBD) وغيرها من اضطرابات الجهاز الهضمي 8 –= "XREF"> 14. وغالبا ما تستخدم خطوط الخلايا الظهارية في الأمعاء خلد لدراسة الخلايا الظهارية استجابات محددة. ومع ذلك، لأن التعبير الجيني التفاضلية وظيفة في الخلايا خلد، حصلت على البيانات من استخدام هذه الخلايا غالبا ما لا تتطابق مع تلك التي لوحظت في الدراسات المجراة. سرداب الأمعاء عضي الثقافة برزت مؤخرا كأداة محتملة لتقييم استجابة ظهارة الأمعاء لمختلف المحفزات 13. في هذا النظام، ويسمح للخلايا الجذعية سرداب في النمو وتطوير هيكل عضوي الشكل 3D. في حين أن نظام الثقافة عضوي الشكل هو مفيد جدا لدراسة جوانب كثيرة من ظهارة الأمعاء، فإنه لا تحاكي التفاعل المعقد بين الخلايا المناعية والخلايا الظهارية والمنتجات الميكروبية. ثقافة فيفو السابقين من الأنسجة المعوية تقدم تمثيل أفضل للفي الجسم الحي الردود دفاع المضيف. في هذه الطريقة، وهي جزء من الأمعاء هو مثقف في لوحة الثقافة خلية خفة دمح وسائل الإعلام المناسبة السماح للأنواع المختلفة من السكان الخلية في الأمعاء وتكون نشطة عملية الأيض لمدة 48 ساعة على الأقل. وبالتالي، ثقافة فيفو السابقين من الجهاز يمكن استخدامها لقياس التعبير عن الجينات المضادة للميكروبات والردود دفاع المضيف من الأمعاء لحافز معين.
وكان المحققون باستخدام نظام الجهاز ثقافة فيفو السابقين لدراسة الردود دفاع المضيف ضد العدوى الميكروبية في الأمعاء 15-21. اعتمدنا مؤخرا نظام الثقافة الجهاز لدراسة دور inflammasome في الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات في كولون الماوس 22. وinflammasome هي عبارة عن منصة الجزيئية لتفعيل كاسباس 1، وهو مطلوب لإنتاج نضجت IL-1β و IL-18. أظهرنا أن IL-1β و IL-18 حمل الببتيدات المضادة للميكروبات التي تقتل بشكل فعال pathobionts المتعايشة مثل كولاي </em>. وكانت هذه الملاحظة بما يتفق مع زيادة عبء كولاي في كولون الماوس inflammasome معيب 22. هذا النظام وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة دور مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) وغيرها من الجزيئات المناعية الفطرية في ردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات المعوية وكذلك التسبب في اضطرابات الأمعاء مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) وسرطان القولون والمستقيم (CRC). هناك أكثر من 200 الجينات IBD قابلية، والطفرات في كثير من هذه الجينات ترتبط مع تكوين الجراثيم تغير في القناة الهضمية. ومن الأهمية السريرية كبيرة لتحديد الآلية الدقيقة التي من خلالها الجينات IBD-القابلية تنظم الجراثيم القناة الهضمية. ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة لإدخال البروتوكول الأساسي من خارج الحي الثقافة الجهاز القولون وإظهار كيف أن هذا الأسلوب يمكن استخدام الثقافة لدراسة الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات في الأمعاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا الظهارية في الأمعاء حساسة جدا من حيث متطلبات نموها وبالتالي يصعب الثقافة. الخلايا الظهارية المعزولة عن طريق العلاج EDTA لا البقاء على قيد الحياة في وسائل الإعلام ثقافة الخلية التقليدية مثل DMEM 8. لذلك، ودراسات التفاعل المضيف الممرض باستخدام سرداب ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مرض كرون والتهاب القولون مؤسسة من أمريكا، (CCFA، 3711) الوقاية من السرطان ومعهد بحوث من ولاية تكساس، مركز UT ساوث ويسترن الطبي (CPRIT RP160169)، ونظرا لMHZ
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
References
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).
- Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).
- Wu, H. J., Wu, E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).
- Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).
- Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. Innate immunity in disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).
- Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. Intestinal epithelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).
- Autrup, H. Explant culture of human colon. Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).
- Qin, J., et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 464, 59-65 (2010).
- Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut. 61, 961-962 (2012).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. 63, 1345-1354 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61, 1007-1015 (2012).
- Haque, A., et al. Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants. Gut. 53, 1424-1430 (2004).
- Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro. Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).
- Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun. 44, 514-518 (1984).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J Anat. 134, 459-469 (1982).
- Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli. Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).
- Bareiss, P. M., et al. Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa. Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).
- Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants. J Vis Exp. , e4368 (2013).
- Hu, S., et al. The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense. Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).
- Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium. J Pathol. 180, 102-105 (1996).
- Dame, M. K., et al. Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).
- Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni. FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).
