בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

הניסויים נערכו על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת בעלי חיים למחקר באוניברסיטת תל אביב. 1. ניתוק של רקמת לבלב מעכברים עבור עכברים בוגרים: הכן את החיץ העיכול: 0.4 מ"ג / P collagenase מ"ל ו 0.1 ng / mL DNase אני מומס תמיסת מלח מאוזן "הנקס (HBSS). טרי להכין 5 מ"ל של חיץ לכל עכבר צינורות חרוטי 15 מ"ל ולשמור אותם על הקרח עד לשימוש. להרדים את העכברים על פי הנחיה מוסדית. לנתח כל עכבר כדי להסיר את הלבלב (להוראה, אנא ראה חומר עזר 18); ומניחים אותו בצלחת תרבות המכילה HBSS. אפשר לבצע בשלב זה תחת סטראו, וכדי להגביר את יעילות עיכול, לחתוך את הרקמה לתוך 2 – 4 חתיכות. מניחים את רקמת לבלב לתוך צינור המכיל מאגר העיכול (מוכן בשלב 1.1.1). שמור את הצינורות על קרח עד שכל העכברים הם גזורים ורקמות לבלבשנאסף. חזור על שלבים 1.1.2 – 1.1.4 עם עכברים הנותרים. עבור עוברים ועכברים בילוד: הכן את החיץ העיכול: 0.4 מ"ג / P collagenase מ"ל ו 0.1 ng / mL DNase אני מומס HBSS. עבור עוברי לגורים ב יום לאחר הלידה 7 (P7) ומטה, טרי להכין 1.5 – 2 מ"ל של חיץ לכל עכבר בתוך שפופרת 15 מ"ל קונית. לקבלת P7 או גורים מבוגרים, להכין 3 – 4 מ"ל של חיץ לכל עכבר בתוך שפופרת 15 מ"ל קונית. שמור על הקרח עד לשימוש. להרדים את העכברים על פי הנחיה מוסדית. עבור עוברי, להסיר את כל העוברים מן הרחם של אמא שלהם ומניחים אותם בצלחת תרבות 10 מ"מ המכיל PBS. לנתח עובר אחד בכל פעם. הנח את העכבר על הגב שלה, עם הראש שלה מצביע הרחק החוקר. בעזרת מלקחיים בסדר, להרים את עור הבטן ופתוח על קו האמצע כדי לחשוף את חלל הבטן עד סרעפת העכבר 18. בעזרת מלקחיים בסדר, לנתק את הכבד frאום דופן הבטן האחורית. בתנועה רציפה לקראת זנב עכבר, לגרוף את האיברים הפנימיים (כולל הכבד, הקיבה, הטחול, המעיים, הכליות והלבלב) ומניחים אותם בצלחת תרבות המכילה HBSS. תחת סטראו, להסיר את הכבד והכליות לחשוף את הלבלב (איור 1). בעזרת מלקחיים בסדר, לנתק את הלבלב מהבטן, תריסריון, ולבסוף, מן הטחול. מניחים את רקמת לבלב לתוך צינור המכיל מאגר העיכול (מוכן בשלב 1.2.1). עבור גורים P14 ומעלה, לחתוך את הרקמה לתוך 2 חתיכות כדי להגביר את יעילות העיכול. שמור את הצינורות על קרח עד שכל העכברים הם גזורים ורקמות לבלב שנאספו. חזור על שלבים 1.2.2 – 1.2.6 עם עכברים הנותרים. 2. עיכול לבלב דגירת הצינורות המכילים את רקמת הלבלב (חיץ עיכול) בתוך גוש חימום על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם agitatיון ב 700 סל"ד. לאחר 15 דקות, ידני לנער את הצינורות על ידי היפוך אותם 3 – 4 פעמים ומניחים אותם בחזרה בבלוק החימום. הערה: אם באמצעות בלוק חימום ללא יכולות תסיסה, להפוך את הצינורות כל 5 – 10 דקות. ודא כי הרקמה מתעכל כראוי. אם לא, לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות יותר לפני הדגירה או להגדיל את התסיסה. כדי לעצור את עיכול רקמות, מניחים את הצינורות על הקרח ולהוסיף 10 מ"ל של HBSS קר צינור אחד. צנטריפוגה צינורות ב 4 ° C ו- XG 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. Re-השעיה: עבור עכברי בוגרים P14 או גורים מבוגרים, מחדש להשעות את הגלולה עם 6 מיליליטר של PBS ו לסנן אותם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר מונחת על גבי צינור פוליפרופילן אוסף חרוטים חדש של 15 מיליליטר. כדי להבטיח התאוששות התא מקסימלי, לשטוף את הצינור המקורי עם תוספת 6 מ"ל של PBS ו מסננים אותו דרך מסננת התא על צינור איסוף. עבור עוברים גורים צעירים tP14 האן, מחדש להשעות את גלולה עם 2 מ"ל של PBS ו לסנן אותם דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מונח על גבי צינור איסוף קלקר 5 מ"ל מסביב לתחתית (צינור FACS). כדי להבטיח התאוששות תא מקסימלי, לשטוף את הצינור המקורי עם תוספת 2 מיליליטר של PBS ו מסנן אותו דרך מסננת התא על צינור האיסוף. צנטריפוגה צינורות ב 4 ° C ו- XG 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. הסר את הנוזל בזהירות, כמו תאים המחוברים באופן רופף אל צינור הקלקר. 3. הכנת תווית תאים בודדים ההכנות הצפת: בידוד תא על ידי FACS, להכין מיון חיץ על ידי ערבוב PBS (ללא כלוריד סידן מגנזיום כלוריד), 5% בסרום שור העובר (FBS), ו -5 מ"מ EDTA. עבור ניתוח תזרים cytometry, להכין חיץ ניתוח על ידי השלמת חיץ מיון עם אזיד הנתרן 0.05%. מאגרי שניהם עשויים להיות מאוחסן על 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד 2 חודשים. מחדש להשעות תאים למיון או anaחיץ תמוגה. Re- להשעות כל הלבלב מבודד עוברים גורים מתחת לגיל P7 ב 1 מ"ל, מן הגורים בין P8 ו בן חודש ב 1.5 מ"ל, ו מעכברים מבוגרת חודש 3 מ"ל. מסננים את התאים דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מונח על גבי צינור פוליסטירן מסביב לתחתית (צינור FACS). עבור פקדים מכתימים, להוציא 50 עד 100-μL aliquots ממדגמים שבוצעו בשלב הקודם (לא יותר מ -5% מנפח כלל המדגם) ולהכניס אותם לתוך צינורות FACS חדשים; כולל צינור עבור כל fluorophore בשימוש, כולל חלבוני DAPI ו ניאון, כמו גם עבור פקד בלא כתם. הערה: בעת שימוש בעכברים טרנסגניים עם תאי מבטאי חלבון פלואורסצנטי, או כאשר המספר סלולארי מוגבל, כולל רקמות הלא מהונדס כביקורת מכתימה. אם תאי מבטאי חלבון פלואורסצנטי משמשים ללא מכתים נוסף, המשך לשלב 3.8. ספין למטה התאים ב 300 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו לשאוב supernatant. לקבלת גושמלך, מחדש להשעות את התאים עם פתרון חסימה (100 μL למיון או חיץ ניתוח בתוספת 1 μL של IgG עז) דגירה במשך 30 דקות על הקרח. כדי להכתים סמנים פני התא, להכין תערובת הכוללת את כל הנוגדנים fluorophore מצומדות הרצוי בהיקף של 100 μL לדגימה. כן דילולי נוגדן 2x במיון או חיץ ניתוח (כלומר, לדלל את הנוגדן להשיג את הריכוז הנדרש כפול; אם דילול סופי של 1: 200 הוא רצוי, לדלל את הנוגדן 1: 100). מבלי לשטוף היטב את הפתרון החוסם, להוסיף 100 μL של התערובת אל התאים המדגמים כדי להשיג נפח מכתים סופי של 200 μL. דגירה של 30-60 דקות על הקרח בחושך. כדי להגדיר את הניתוח או פרמטרי מיון (ראה צעדים 4.3 ו -5.2), להכין צינורות נוספים המכילים רק אחד הנוגדנים המשמשים (שליטה מכתימה). כן דילולי נוגדן 2x במיון או חיץ ניתוח (כמתואר בשלב 3.6). הקפד לכלול סידילול מלא מכתים ngle לכל fluorophore בשימוש, כמו גם פקד בלא כתם. מבלי לשטוף היטב את הפתרון חוסם, להוסיף 100 μL של תערובות נוגדנים לתאי (מוכן בשלב 3.3) כדי להשיג נפח מכתים סופי של 200 μL. דגירה של 30 – 60 דקות על הקרח בחושך. לשטוף על ידי מילוי צינור אחד עם ניתוח או מיון חיץ לנפח מקסימאלי של 4 מיליליטר. לחלופין, מחדש נקע את התאים דרך מסננת תא 35 מיקרומטר (כמתואר בשלב 3.2). צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant בזהירות. מחדש להשעות את הדגימות בניתוח או מיון חיץ. Re- להשעות את התאים מבודדים מעוברים ב 500 μL, מן הגורים מתחת לגיל חודש ב 1 מ"ל, מ 1 – 3 חודשים הישן 2 מ"ל, ו מעכברים מעל גיל 3 חודשים ב 3 מ"ל. בקרות מכתימות ניתנות מחדש תלויות 300 μL של חיץ. הוספת 200 ng / mL של DAPI מחדש מושעה תאים לזהות את התאים המתים. הקפד לכלול שיתוף צינורntaining תאים בלא כתם ללא DAPI עבור הגדרות cytometer. המשך מיון תא (שלב 4) או ניתוח (שלב 5). 4. מיון תאים כנות: עבור מיון התא לפני מיצוי RNA, מעיל צינור איסוף 1.5 מ"ל עם RNase מעכב מיד לפני מיון. לשם כך, להוסיף 1 מ"ל של מיון חיץ, המכיל 0.01 U / mL RNase מעכב, אל צינור 1.5 מ"ל אוסף סטרילי. לאחר 5 דקות, מערבולת הצינור ולהסיר את הנוזל. עבור מיון התא לפני תרבית תאים, להוסיף 3 מ"ל של התקשורת culturing סטרילי (בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) השלימו עם FBS 20%, 1% L- גלוטמין, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין) לתוך צינור איסוף 15 מ"ל סטרילי . לפני טעינת שפופרת לתוך סדרן FACS, מערבולת אותו קלות על מנת מחדש להשעות את התאים. שמור את הצינורות הנותרים על קרח. התחל על ידי ניתוח הבקרות המכתימות מנת לקבוע את פרמטרי המיון (למשל, </em> מתח ופיצויים) ומיון שערים (למשל, אוכלוסיית תאים כוללת, תאי DAPI שלילי חיות, אוכלוסיות תאים להיות מסודרים). לאחר הפרמטרים ושערי מיון מוגדרים, טען את הדגימות וליזום מיון תא לתוך הצינורות האוספים. הערה: תנאי מיון הם תלויים במידה רבה על המכשיר. אנו משתמשים ברוחב זרבובית של 100 מיקרומטר, בלחץ של 23.1 psi, ומהירות מיון מקסימלי של 5. המשך מיצוי RNA או culturing של תאים ממוינים. הערה: לקבלת מיצוי RNA, צנטריפוגה התאים XG ב 2000 במשך 5 דקות ולהסיר את הנוזל העודף לפני שתמשיך עם פרוטוקול מיצוי סטנדרטי. עבור culturing תאים, אם התאים מוינו בתנאים לא סטריליים, לשטוף אותם פעמיים על ידי מילוי צינור עם המדיום culturing ו צנטריפוגה זה ב XG 300 7 דקות לפני culturing כדי למזער זיהום שלהם. 5. ניתוח Cell על ידי cytometry זרימה לפני שאניoading כל צינור לתוך, מערבולת cytometer אותו קלות על מנת מחדש להשעות את התאים. שמור את הצינורות הנותרים על קרח. התחל על ידי ניתוח דגימות בלא כתם חד מוכתם על מנת לקבוע את הפרמטרים ניתוח (לדוגמה, מתח ופיצויים). לאחר הפרמטרים ניתוח מוגדרים, לטעון כל דגימה, כולל בקרת מכתים, ולהקליט את התוצאות. לנתח את התוצאות שהושגו באמצעות זרימת cytometry תוכנה לניתוח.