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Developmental Biology

Isolierung und Analyse von Zellen des Pankreas Mesenchyme durch Durchflusszytometrie

Published: January 28, 2017
doi:
10.3791/55344
, ,
1Cell and Developmental Biology,Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von Zellen in der Bauchspeicheldrüse Mikroumgebung aus embryonalen, neonatalen und adulten Mausgewebe, auf die Isolierung von mesenchymalen Zellen konzentriert. Dieses Verfahren ermöglicht Profilieren von Zell Genexpression und Proteinabsonderung, um die extrinsische Signale zu erläutern, die Pankreas-Entwicklung, Funktion und tumorigenesis regulieren.

Abstract

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

Introduction

Energie-Homöostase und Verdauung der Nahrung bei Säugetieren hängt von der richtigen Funktion der Bauchspeicheldrüse. Die adulten Pankreas besteht aus zwei Haupt Zellkompartimente: der exokrinen und endokrinen. Exokrinen Zellen, die Azinuszellen einschließlich , die produzieren und Verdauungsenzyme und die Kanal Zellen sezernieren, die diese Enzyme in den Magen transportieren, umfassen mehr als 80% der gesamten Pankreasmasse 1. Endokrine Zellen, die Insulin-produzierenden Beta – Zellen und Glucagon-produzierenden alpha Zellen umfassen, sind in den Langerhans'schen Inseln organisiert, die in dem exokrinen Gewebe eingebettet sind und Hormone absondern , um Blutzuckerspiegel 2 zu regulieren.

Bauchspeicheldrüsenzellen erhalten ihre differenzierte Schicksal durch eine hochreguliert, mehrstufiger Prozess 3. Hinweise darauf, dass extrinsische Signale durch neuronale vorgesehen, endotheliale und mesenchymale Zellen führen Pankreaszelldifferenzierung und Proliferation in ter embryo 3, 4, 5. Ein Beispiel ist die Anforderung der Aorta für die Spezifikation der frühen Pankreas Vorläufern 6. Später in der Entwicklung wurden Endothelzellen gezeigt , die eine zentrale Rolle bei der Entwicklung der beiden pankreatische endokrine und exokrine Zellen spielen und Beta-Zelldifferenzierung 4, 6, 7 zu fördern. Mesenchymale Zellen wurden gezeigt , das Überleben und die Expansion von gemeinsamen Pankreas – Vorläufern zu unterstützen, vor allem durch die Sekretion des Wachstumsfaktors FGF10 8, 9. Wir haben ferner gezeigt , dass diese Zellen die Proliferation von endokrinen und exokrinen Vorläufern sowie von differenzierten Zellen (einschließlich acinar und Beta – Zellen) in der embryonalen Pankreas 5 unterstützen. Vor kurzem wurden mesenchymale Zellen weitergezeigt zu endokrinen Zellen Differenzierung 10 regulieren.

Im erwachsenen, beta-Zell – Funktion und Masse wurden auf die Zellen in ihrer Mikroumgebung abzuhängen gezeigt, einschließlich neuronaler, Immun- und Endothelzellen sowie Perizyten 11, 12, 13. Während Verletzungen wurden Endothelzellen Immunzellen der Bauchspeicheldrüse zu rekrutieren Beta-Zell – Replikation 13 zu fördern. Endotheliale Zellen wurden weiter extrazellulären Matrix (ECM) -Komponenten zu erzeugen gezeigt Insulinexpression und Beta-Zell – Funktion 14 zu unterstützen. Wir haben kürzlich gezeigt , die Anforderung von Insel pericytes für Beta-Zell – Funktion 11. Schließlich wurden die Zellen des Pankreas Stroma gezeigt , um die Progression von duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) 15, 16 zu regulieren. Jedoch ist die idEinheit von extrinsischen Hinweise, die Bauchspeicheldrüse Entwicklung, Funktion und tumorigenesis führen sind weitgehend unbekannt.

Identifizieren von Zellen des Pankreas Mikroumgebung bereitgestellt cues benötigt von diesen Zellen exprimiert wird, die die Gene und Proteine ​​zu charakterisieren. Dies hängt diese Zellen aus der Bauchspeicheldrüse, um auf die Isolierung der Genexpression und Proteomik-Analysen und / oder auf die Schaffung Zelllinien durchzuführen. Hier schlagen wir ein Verfahren zur mesenchymalen Zellen des Pankreas Mikroumgebung isolieren durch Gewebe enzymatischen Verdau und fluoreszenzaktivierten Zellsortierung unter Verwendung von (FACS) von entweder immunofluorescently markierten Zellen oder Zellen, die fluoreszierende Proteine. Dieses Protokoll wurde erfolgreich zu isolieren und zu analysieren , gelb fluoreszierendes Protein (YFP) exprimierenden mesenchymalen Zellen des embryonalen, neonatalen und adulten Pankreas 5, 17 durchgeführt.

Protocol

Die Experimente wurden nach Protokollen, die vom Ausschuss für Tierforschung an der Universität Tel Aviv genehmigt durchgeführt. 1. Isolierung von Pankreasgewebe von Mäusen Für erwachsene Mäuse: Bereiten Sie die Aufschlusspuffer: 0,4 mg / ml Kollagenase P und 0,1 ng / ml DNase I in Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) gelöst. Frisch herstellen 5 ml Puffer pro Maus in 15 ml konischen Röhrchen und halten sie auf Eis bis zum Gebrauch. Euthanize die Mäuse nach institutionellen Richtlinie. Sezieren jede Maus, um die Bauchspeicheldrüse zu entfernen (für den Unterricht finden Sie unter Referenz 18); legen Sie sie in einer Kulturschale enthält HBSS. Es ist möglich, diese Stufe unter einem Stereomikroskop durchzuführen, und die Verdauung Effizienz zu erhöhen, schneiden Sie das Gewebe in 2-4 Stücke. Legen Sie das Pankreasgewebe in ein Röhrchen, das Verdauungspuffer (hergestellt in Schritt 1.1.1). Halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis alle Mäuse seziert und Pankreasgewebegesammelt. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2 – 1.1.4 mit den restlichen Mäusen. Für Embryonen und Neugeborenen – Mäuse: Bereiten Sie den Verdauungspuffer: 0,4 mg / ml Kollagenase P und 0,1 ng / ml DNase I in HBSS gelöst. Für Embryonen und Welpen am postnatalen Tag 7 (P7) oder jünger, bereiten frisch 1,5-2 ml Puffer pro Maus in 15 ml konischen Röhrchen. Für p7 oder ältere Welpen, bereiten 3-4 ml Puffer pro Maus in 15 ml konischen Röhrchen. Halten Sie sich auf Eis bis zum Gebrauch. Euthanize die Mäuse nach institutionellen Richtlinie. Für Embryonen, entfernen Sie alle Embryonen aus ihrer Gebärmutter und legen Sie sie in einem 10-mm-Kulturschale mit PBS. Sezieren einen Embryo zu einem Zeitpunkt. Legen Sie die Maus auf dem Rücken, mit seinem Kopf vom Prüfer weg zeigt. Mit einer feinen Pinzette, ziehen Sie den Bauchhaut und offen an der Mittellinie bis zur Maus Membran 18 in die Bauchhöhle zu belichten. Mit einer feinen Pinzette, lösen die Leber from den hinteren Bauchwand. Mit einer kontinuierlichen Bewegung in Richtung der Maus Schwanz, eine Schaufel, die inneren Organe (einschließlich der Leber, Magen, Milz, Darm, Niere und Bauchspeicheldrüse) und legen Sie sie in einer Kulturschale mit HBSS. Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie die Leber und die Nieren , die Bauchspeicheldrüse (Abbildung 1) zu belichten. Mit einer feinen Pinzette lösen sich die Bauchspeicheldrüse aus dem Magen, Zwölffingerdarm und schließlich aus der Milz. Legen Sie das Pankreasgewebe in ein Röhrchen, das Verdauungspuffer (hergestellt in Schritt 1.2.1). Für p14 oder ältere Welpen, schneiden Sie das Gewebe in 2 Stücke, die Verdauung Effizienz zu erhöhen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis alle Mäuse seziert und Pankreasgewebe gesammelt. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.2 – 1.2.6 mit den restlichen Mäusen. 2. Pancreas Verdauung Inkubieren der Röhrchen der Pankreasgewebe (in Verdauungspuffer) in einem Heizblock bei 37 ° C für 30 min mit agitat enthaltendIon bei 700 Upm. Nach 15 min schütteln manuell die Rohre, indem sie 3 Umkehren – 4-mal und legen Sie sie zurück in den Heizblock. HINWEIS: Wenn ein Heizblock ohne Bewegung Fähigkeiten verwenden, invertieren die Rohre alle 5 – 10 min. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe richtig verdaut wird. Wenn nicht, schneiden Sie das Gewebe in kleinere Stücke vor der Inkubation oder die Bewegung zu erhöhen. Um das Gewebe Verdauung zu stoppen, legen Sie die Röhrchen auf Eis und 10 ml kaltem HBSS in jedes Röhrchen. Zentrifugiere die Röhrchen bei 4 ° C und 300 xg für 5 min und den Überstand aspirieren. Re-Suspension: Bei erwachsenen Mäusen und p14 oder ältere Welpen, das Pellet mit 6 ml PBS erneut suspendieren und durch ein auf einem neuen 15-ml konischen Sammlung Polypropylen-Röhrchen platziert 70-um-Zelle Sieb abgießen. Um eine maximale Erholung der Zellen zu gewährleisten, waschen Sie die Original-Rohr mit einem zusätzlichen 6 ml PBS und spannen Sie es durch die Zelle Sieb auf das Sammelrohr. Für Embryonen und Welpen jünger than p14, das Pellet mit 2 ml PBS erneut zu suspendieren und durch ein auf einem 5-ml-Rundboden-Polystyrolsammelröhrchen (FACS-Röhrchen) platziert 35-um-Zelle Sieb abgießen. Um eine maximale Erholung der Zellen zu gewährleisten, waschen Sie die Original-Rohr mit einem zusätzlichen 2 ml PBS und spannen Sie es durch die Zelle Sieb auf das Sammelrohr. Zentrifugiere die Röhrchen bei 4 ° C und 300 xg für 5 min und den Überstand aspirieren. Entfernen Sie die sorgfältig Flüssigkeit, wie Zellen werden lose an das Polystyrolröhrchen befestigt. 3. Vorbereitung Einzelzellen Beschriftet Buffer Zubereitungen: Bei Zellisolierung durch FACS, bereiten Sortierpuffer von PBS Mischen (ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid), 5% fötalem Rinderserum (FBS) und 5 mM EDTA. Für die Durchflusszytometrie-Analyse, Analyse Puffer durch Ergänzung Sortierpuffer mit 0,05% Natriumazid vorzubereiten. Beide Puffer kann bis zu 2 Monate bei 4-8 ° C gelagert werden. Resuspendieren Zellen in dem Sortieren oder anaLysepuffer. Re-suspend jeweils Bauchspeicheldrüse isoliert von Embryonen und Welpen jünger als p7 in 1 ml, von Welpen zwischen p8 und einen Monat alt in 1,5 ml, und von Mäusen, die älter als ein Monat in 3 ml. Strain die Zellen durch ein 35 & mgr; m Zellsieb auf einem Rundboden-Polystyrolröhrchen (FACS tube) gegeben. Für Kontrollen Färbung nehmen 50- bis 100-ul-Aliquots aus den Proben im vorherigen Schritt (nicht mehr als 5% der gesamten Probenvolumen) aus und legen Sie sie in neue FACS-Röhrchen; umfassen eine Röhre für jede verwendete Fluorophor, einschließlich DAPI und fluoreszierende Proteine, sowie für eine ungefärbte Kontrolle. HINWEIS: Bei transgenen Mäusen, die mit Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzprotein exprimieren, oder wenn die Zellzahl begrenzt ist, umfassen eine nicht-transgenen Gewebe als Färbungskontrolle. Wenn Zellen ein fluoreszierendes Protein exprimieren, ohne weitere Färbung verwendet werden, gehen 3,8 Schritt. Spin-down die Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C und saugt den Überstand. Bei BlockKönig, resuspendieren der Zellen mit Blocking-Lösung (100 & mgr; l Sortieren oder Analysieren Puffer mit 1 & mgr; l Ziegen-IgG ergänzt) und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Um Zelloberflächenmarker Fleck, bereiten eine Mischung, die alle gewünschten Fluorophor-konjugierte Antikörper in einem Volumen von 100 & mgr; l pro Probe enthält. Bereiten Sie 2x Antikörperverdünnungen in Sortieren oder Analysieren Puffer (dh verdünnen den Antikörper doppelt um die erforderliche Konzentration zu erhalten, wenn eine endgültige Verdünnung von 1: 200 gewünscht wird, verdünnt den Antikörper 1: 100). Ohne die Blockierungslösung gewaschen, mit 100 & mgr; l der Mischung auf den Probenzellen eine endgültige Färbung Volumen von 200 & mgr; l zu erreichen. Inkubieren für 30-60 min auf Eis und im Dunkeln. Um die Analyse oder Sortierparameter eingestellt (siehe Schritte 4.3 und 5.2), bereiten zusätzliche Rohre, die nur einer der Antikörper verwendet (Mal- Kontrolle) enthalten. Bereiten Sie 2x Antikörperverdünnungen in Sortieren oder Analysieren Puffer (wie in Schritt 3.6 beschrieben). Achten Sie auf eine si enthaltenngle Färbung Steuer Verdünnung für jeden Fluorophor verwendet wird, sowie eine ungefärbte Kontrolle. Ohne die Blockierungslösung gewaschen, mit 100 & mgr; l der Antikörpermischungen zu den Zellen (hergestellt in Schritt 3.3) eine endgültige Färbung Volumen von 200 & mgr; l zu erreichen. Inkubieren für 30 – 60 Minuten auf Eis und im Dunkeln. Waschen Sie durch jedes Röhrchen mit Analyse Füllung oder Puffer bis zu einem maximalen Volumen von 4 ml zu sortieren. Optional die Zellen durch ein 35-um-Zelle Sieb abgießen-re (wie in Schritt 3.2 beschrieben). Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C und der Überstand vorsichtig entfernen. Re-suspendieren die Proben in der Analyse oder Sortierpuffer. Re-suspend die aus Embryonen isolierten Zellen in 500 & mgr; l, von Welpen jünger als einen Monat lang in 1 ml, von 1 – 3 Monate alt in 2 ml, und von Mäusen, die älter als 3 Monate in 3 ml. Anfärben Kontrollen werden in 300 ul Puffer resuspendiert. In 200 ng / ml DAPI erneut zu suspendierten Zellen die toten Zellen zu identifizieren. Achten Sie darauf, ein Rohr co aufzunehmenntaining ungefärbten Zellen ohne DAPI für cytometer Einstellungen. Fahren Sie mit Zellsortierung (Schritt 4) oder Analyse (Schritt 5). 4. Zellsortierung Vorbereitungen: Für Zelle vor der RNA-Extraktion Sortierung, Mantel mit einem 1,5-ml-Sammelröhrchen mit RNase-Inhibitor unmittelbar vor dem Sortieren. Zu diesem Zweck wird 1 mL Puffer Sortierung, die 0,01 U / ml RNase-Inhibitor, in ein steriles 1,5 ml-Sammelröhrchen. Nach 5 min wurde das Röhrchen verwirbeln und die Flüssigkeit zu entfernen. Für Zelle vor der Zellkultur Sortier-, 3 ml sterile Kultivierungsmedium (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit 20% FBS ergänzt, 1% L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin) in eine sterile 15-ml-Sammelröhrchen . Bevor Sie ein Rohr in einen FACS-Sorter Laden, Wirbel es kurz zu resuspendieren der Zellen. Halten Sie die restlichen Röhrchen auf Eis. Starten Sie durch die Färbung Kontrollen Analyse der Sortierparameter zu bestimmen (zB </em> Spannung und Kompensation) und Sortierweichen (zB sortier gesamten Zellpopulation, Live – DAPI-negativen Zellen und Zellpopulationen). Sobald die Sortierparameter und Tore eingerichtet sind, laden Sie die Proben und initiieren Zelle in die Sammelröhrchen zu sortieren. HINWEIS: Sorting Bedingungen sind stark abhängig von dem Instrument. Wir verwenden eine Düsenbreite von 100 um, einen Druck von 23,1 psi und eine maximale Sortiergeschwindigkeit von 5. Gehen Sie zur RNA-Extraktion oder der Kultivierung von sortierten Zellen. HINWEIS: Für die RNA-Extraktion, die Zellen für 5 min bei 2000 × g zentrifugiert werden und die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, bevor sie mit einem Standard-Extraktionsprotokoll fortzusetzen. Zur Kultivierung von Zellen, wenn die Zellen unter nicht sterilen Bedingungen sortiert wurden, waschen Sie sie zweimal durch das Rohr mit Kulturmedium füllt und es bei 300 g für 7 min vor Kultivierung, um ihre Kontamination zu minimieren Zentrifugieren. 5. Zellanalyse mittels Durchflusszytometrie Vor loading jedes Rohr in das Zytometer Vortex kurz darauf, um die Zellen erneut zu suspendieren. Halten Sie die restlichen Röhrchen auf Eis. Beginnen Sie, indem Sie die ungefärbten und Single-gefärbten Proben , um die Analyse der Analyseparameter (zB Spannung und Ausgleich) zu bestimmen. Sobald die Analyseparameter eingerichtet sind, laden jede Probe, einschließlich der Färbung Kontrolle und die Ergebnisse aufzuzeichnen. Analysieren Sie die erhaltenen Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse-Software.

Representative Results

Die Pankreas-Mesenchym wird während der Entwicklung und im Erwachsenenalter erforderlich. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Isolierung von mesenchymalen Zellen aus dem embryonalen, neonatalen und adulten Pankreas. Mesenchymalen Zellen, aber keine anderen Zelltypen exprimieren gelb fluoreszierendes Protein (YFP) in der Bauchspeicheldrüse von Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP Mäuse 5, 11, 17, 19. Während der Entwicklung Nkx3.2 (auch als BapX1 bekannt) wird von embryonalen Pankreas, Magen und Darm Mesenchym exprimiert, sowie in einer Untergruppe von Skelett Somiten 19, 20, 21. Dieses Gen wurde in den Pankreas Mesenchym von E9.5 bis E11.5 ausgedrückt, die Genexpression unter der Kontrolle von Nkx3.2 -Cre von E9.5 5 ermöglicht, </sup> 19, 20. Basierend auf dieser Kennzeichnung können Zellen aus bulk Pankreasgewebe gereinigt werden unter Verwendung von Durchflusszytometrie. Abbildung 2 zeigt eine Durchflusszytometrie – Analyse von Einzelzellen aus embryonalen, neonatalen und erwachsenen Pankreasgewebe isoliert , wie hier beschrieben. Während nicht-transgenen nicht Pankreasgewebe fluoreszierende Zellen enthalten, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP Pankreasgewebe von allen untersuchten Altersgruppen enthält eine deutliche YFP-markierten Zellpopulation (Abbildung 2, mit Toren markiert). Nach dem hier beschriebenen Verfahren werden Zellen fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, können entweder gereinigt oder durch Strömungs analysiert werden cytometry, mit oder ohne zusätzliche Immunfärbung. Beispielsweise nach basierend auf Fluoreszenzmarkierungs Sortierung kann Mesenchymzellen kultiviert werden , um eine Zelllinie herzustellen (für mindestens fünf Passagen), wie in 3A gezeigt. Hinweis t er fibrocytic Morphologie der kultivierten Zellen, die typisch für mesenchymale Zellen. Darüber hinaus wurde dieses System von sortierten Zellen zur Analyse der Genexpression verwendet. Dazu wurde RNA aus sortierten mesenchymalen Zellen extrahiert cDNA zu synthetisieren und Genexpressionsniveaus wurden durch qPCR analysiert. Eine solche Analyse ergab , dass sortierten Zellen , die den pan-mesenchymalen Marker Vimentin (3B) exprimieren. Schließlich kann die Expression Oberflächenmarker von Pankreaszellen durch Durchflusszytometrie analysiert werden. Beispielsweise isoliert man Zellen aus dem Pankreasgewebe von Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP erwachsenen Mäusen unter Verwendung des Verfahrens hier beschriebenen und gefärbt sie mit der Zelloberfläche CD9 – Glycoprotein, von dem berichtet wurde von Fibroblasten 22 ausgedrückt werden. Wie in 3C gezeigt, werden alle Zellen in der Nkx3.2 -Cre fluoreszenzmarkierten; R26R -YFP Bauchspeicheldrüse ausdrücken CD9. tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg "/> Abbildung 1: Embryonale und neonatalen Pankreasgewebe. Isolierte gesamten Gastrointestinaltrakt, einschließlich der Magen, Milz, Darm und Pankreas eines E15.5 Embryonen (A) und einem p4 Pup (B). Das Pankreasgewebe ist mit einer blauen Linie abgegrenzt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: mesenchymale Zellen fluoreszenz in Nkx3.2 -Cre markiert; R26R -YFP Pankreasgewebe. Durchflusszytometrie – Analyse von pankreatischen Zellen isoliert aus nicht-transgenen (linke Felder) und Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP transgenen (rechte Felder) Mäuse in verschiedenen Altersstufen: Embryonale (A), Neugeborenen (B) und adult (C). Zellen wurden für Seitenstreuung (y-Achse) und gelber Fluoreszenz (x-Achse) analysiert. Tore (markiert mit "D") zeigte die Anwesenheit einer in transgenen Mäusen Zellpopulation YFP + aber nicht in nicht-transgenen Kontrollen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Die Analysen von isolierten Zellen der Bauchspeicheldrüse. (A) Zellen aus dem Pankreasgewebe von Nkx3.2 -Cre sortiert; R26R -YFP neonatale Mäuse (wie in 2B beschrieben) wurden eine Zelllinie zu etablieren. Kultivierte Zellen wurden für die Fluoreszenz abgebildet (grün, rechts und links Platten) und Phasenkontrast (grau; rechtes Bild). (B) Balkendiagramm zeigt Vimentin1 (Vim1)Expressionsniveaus von YFP + -sortierte Zellen aus dem Pankreasgewebe von Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP erwachsenen Mäusen (wie in 1C beschrieben; grün) , im Vergleich zu unsortierten Pankreasgewebe (schwarz). RNA wurde extrahiert und die Genexpression wurde durch qPCR analysiert; Expression wurde auf Cyclophilin normalisiert. N = 4. *** P <0,001. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD. (C) Durchflusszytometrie Analyse verteilt Pankreaszellen aus Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP erwachsene Mäuse immun gefärbt mit Allophycocyanin (APC) -konjugiertem anti-CD9 – Antikörper und analysiert für APC (y-Achse) und gelber Fluoreszenz (x-Achse). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung und Zellen der pankreatischen Mikroumgebung zu analysieren. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um mesenchymale Zellen aus embryonalen und adulten Pankreasgewebe zu isolieren. Darüber hinaus dieses Protokoll zu isolieren Endothelzellen aus der Erwachsenen und Neugeborenen Pankreas 5, haben wir erfolgreich 17. Es kann jedoch nicht geeignet sein für eine reproduzierbare Einzelzellsuspension von pankreatischen epithelialen Zellen erhalten (alternative Protokolle sind in der Literatur beschriebenen 18, 23 und 24). Unter Verwendung dieses Verfahrens fluoreszenzmarkierte Zellen, entweder exprimieren Oberflächenmarker fluoreszierende Proteine ​​oder immunhistochemisch kann mittels Durchflusszytometrie durch FACS analysiert oder gereinigt werden. RNA kann aus gereinigten Zellen extrahiert werden, um ihre Genexpressionsmuster zu profilieren. Alternativ können gereinigten Zellen kultiviert werden, um eine Zelllinie für die nachfolgende Proteomanalyse zu etablieren. Diese Methode wird die Charakterisierung von Faktoren e ermöglichenxpressed von der Bauchspeicheldrüse Mikroumgebung, die ihre Organogenese, Physiologie regieren, und Pathophysiologie.

Das Pankreas Mesenchyms unterstützt Gewebe organogenesis durch die Proliferation von Vorläufern zu fördern und differenzierten Zellen 5, 9. Diese Zellen wurden gezeigt , um die Expansion von humanen embryonalen Stammzellen unterstützen (hESC) abgeleitetes Pankreas – Vorläufern 17, 25, 26. Daher würde erleichtern die Identität der embryonalen mesenchymalen Faktoren Abgrenzen derzeitigen Bemühungen Insulin-produzierenden Beta-Zellen aus hES-Zellen und induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) als potenzielle Heilmittel für Diabetes zu erzeugen. Maus genetische Studien ermöglichte die Identifikation von Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise FGF10, die von dem Mesenchym produziert werden pankreatischen Epithel Expansion während der frühen Stadien der Entwicklung zu fördern Bauchspeicheldrüse3, 9. Mit dem Ziel , in der embryonalen Mesenchym ausgedrückt zusätzliche Faktoren zu identifizieren, isolierten wir diese Zellen mit Laser-Capture – Mikrodissektion, extrahiert ihre RNA und durchgeführt Genexpressionsanalyse 26. Jedoch zusätzlich zu arbeitsintensiv zu sein, dieses Verfahren beruht auf Zellen basierend auf ihren morphologischen Merkmalen, die schränkt ihre Verwendung zur Entwicklungsstadien vor der Verzweigung des Epithels in das umgebende Mesenchym (dh E12.5) identifiziert. Um mesenchymalen Zellen in späteren Entwicklungsstadien zu charakterisieren, setzten wir das hier beschriebene Verfahren 5, 17.

Wir haben dieses Verfahren zur Oberflächenmarker Ausdruck von Neugeborenen Pankreas Mesenchyms 5 analysieren. R26-EYFP – Mäusen, bezogen auf; außerdem wurden mesenchymale Zellen aus embryonalen und neonatalen Pankreasgewebe von Nkx3.2 -Cre isoliertihre Fluoreszenzmarkierung in dieser Mauslinie und waren gezüchteten Zelllinien 17 zu etablieren. Die Proteomik – Analyse dieser für die Identifizierung von Faktoren , die von den Pankreas Mesenchym mit der Fähigkeit erlaubt Zellen sekretiert 17 hES-abgeleitete Bauchspeicheldrüsen Progenitoren zu fördern. Wir weiter diese Zellisolierung Methode verwendet , um mesenchymale Zellen aus adulten Pankreasgewebe für die RNA – Extraktion und Genexpressionsanalyse 17 reinigen. Daher kann dieses Verfahren verwendet werden, um Gene und Proteine, die durch die Pankreas-Mesenchym exprimiert zu identifizieren, mit der Fähigkeit, Pankreaszellentwicklung zu unterstützen.

Pancreatic mesenchymalen Zellen wurden weiter eine Rolle in der Bauchspeicheldrüse Tumorentstehung spielen gezeigt. PDAC wird durch die Bildung einer Fibroblast-rich desmoplastischen Stroma besteht aus Fibroblasten, Immunzellen und ECM 27 gekennzeichnet. Während wurde das Stroma gedacht, um die Entwicklung von vielen zu fördernKrebsarten wurde gezeigt , PDAC Progression 15, 16, 28 zu begrenzen. Dies legt nahe, dass die Komponenten des Pankreas Stroma Faktoren sezernieren, die Tumorigenese hemmen. Ferner können Änderungen in Stroma zelluläre Zusammensetzung sowie in Zell – Phänotyp kann ihre Wirkung auf Epithelzellen zugrunde liegen 15, 16, 28. Das hier beschriebene Verfahren kann daher in helfen, die verschiedenen Zelltypen zu charakterisieren, die eine PDAC Stroma bilden im Vergleich zu gesunden Pankreasgewebe. Es wäre ferner die Reinigung der verschiedenen stromalen Zelltypen ermöglichen, mögliche Veränderungen in ihrer Genexpressionsprofile während PDAC Progression charakterisieren. Jedoch aufgrund von Änderungen in pankreatischen ECM Zusammensetzung während tumorigenesis 27, Anpassungen der Gewebeverdauungsparameter, wie die Einbeziehung von additional Kollagenase-Typen oder die Inkubationszeit steigt, erforderlich.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.

Materials

Collagenase P Roche 11213865001
DNase Sigma-Aldrich D5025-15KU The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) Sigma-Aldrich H6648
Fetal Bovine Serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
EDTA Biological Industries 01-862-1A
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Goat IgG serum Sigma-Aldrich G9023
DAPI Sigma-Aldrich D9542
RNAse inhibitor Invitrogen N8080119
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965092
L-Glutamine Biological Industries 03-020-1B
Penicillin-streptomycin Biological Industries 03-031-1B
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537 Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride
1.5 ml tubes Sarstedt 72 690
15 ml conical tube Corning 430052
Round Bottom Polystyrene 5 ml tube  Corning 352008 FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands
5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap Corning 352235 FACS tube'  
70 μm cell strainer  Miltenyi Biotec 130-098-462
Heating block with agitation  Eppendorf ThermoMixer C
Centrifuge ThermoFisher Heraeus Megafuge 40R
Steromicroscope Nikon SMZ 745
Cell sorter BD Biosciences FACSAria IIu
flow cytometer Beckman Coulter Gallios 
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References

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Epshtein, A., Sakhneny, L., Landsman, L. Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55344, doi:10.3791/55344 (2017).
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