Usando culturas neurosphere primárias para o Estudo Primário Cilia

O cílio primário é um compartimento subcelular dinâmico baseado em microtúbulos que funciona como uma antena sensorial na coordenação de vias de sinalização celular, incluindo a via de Hedgehog Sonic (Shh), durante o desenvolvimento neuronal embrionário ^{1, 2,} e sinalização subcelular compartimentada em adulto função neuronal ^{3, 4} . Sinalização componentes destas vias, tais como o receptor de Shh Patched ^5; o activador via de Smoothened (Smo) ^6; e Gpr161 ^7, um receptor órfão de Proteína G-acoplada (GPCR) que regula negativamente a via de Shh, localizar aos cílios de uma forma dinâmica. Várias GPCRs têm sido relatados para localizar aos cílios em neurónios no cérebro ^{7, 8, 9, 10} </^{sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Defeitos no cílios e vias de sinalização gerada-cílios afectar vários tecidos e são conhecidos colectivamente como ciliopathies ^{17, 18, 19.} O espectro da doença ciliopathy inclui frequentemente defeitos do neurodesenvolvimento, tais como anomalias craniofaciais ^{20, 21, 22.} Além disso, cílios em neurónios hipotalâmicos regulam vias centrais de saciedade, e defeitos resultam em obesidade central ^23, o espelhamento da obesidade em ciliopathies sindrómicas tais como síndrome de Bardet Biedel ^24. Além disso, o receptor neuropéptido de sinalização em cílios regula central saciedade vias ^{11, 14.} Localização ciliar de adenililciclase III (ACIII) e os GPCRs, tais como o receptor de somatostatina 3 em neurónios do hipocampo resultar em defeitos de reconhecimento de objecto novos e défices de memória ^{25, 26} e paralelo a falta de integridade ciliar ^27. Os aspectos do desenvolvimento da sinalização gerada-cílios estão intimamente ligados a homeostase do tecido; em particular, os cílios são importantes para a progressão de meduloblastomas Shh para o subtipo que derivam de progenitores granulares do cerebelo em ^{28, 29.} Assim, cílios desempenham papéis importantes durante embrionário, pós-natal, e desenvolvimento neuronal adulto e função.

As células estaminais neurais (NSCs) residem na zona subventricular (SVZ) do ventrículo lateral, na zona subgranular do giro dentado do hipocampo, e azona ventricular do terceiro ventrículo no hipotálamo em mamíferos ^{30, 31, 32.} NSCs são multipotentes, possuem a capacidade de auto-renovação, e são importantes para o desenvolvimento do cérebro e da medicina regenerativa ^30. A maioria dos NSC no SVZ são quiescentes e possuem um cílio primário solitário que, em muitos casos, se estende para fora para o ventrículo lateral ^33. Os sinais cílio primários através da localização de vários receptores, a indução de respostas celulares a jusante, particularmente em relação a Shh, TGFp, e receptor de tirosina-quinase vias ^{2, 34, 35, 36.} Uma vez que os cílios se estender para o ventrículo lateral,-se a hipótese de que cílios detectar citoquinas no fluido cerebrospinal (CSF) para activar as NSC ³⁷ </s-se>. Estudos recentes sugerem que a via de sinalização de Shh e cílios são críticos para a activação de células estaminais na reparação e regeneração de vários tecidos, incluindo o epitélio olfactivo, pulmão, rim e ^{38, 39, 40, 41.} No entanto, os mecanismos através dos quais comunica com CSF NSC e se cílios estão envolvidos não são conhecidos. NSC aderentes em cultura são ciliado; localizar os componentes da via, tais como Shh, Smo e Gpr161 em cílios; e são Shh responsivo ^42. Assim, NSC pode servir como um importante sistema modelo para o estudo da via de Shh, tráfico ciliar, e vias de diferenciação neuronal. Além disso, a partir de neurónios diferenciados NSC também podem ser utilizadas para ensaios de tráfico ciliar.

As neuroesferas são constituídos por aglomerados de células flutuantes resultantes da proliferação de neural células estaminais / progenitoras que crescem na presença de factores de crescimento específicos e superfícies não adesivos ^{43, 44.} As neuroesferas servir como importante em modelos de cultura in vitro para estudar as células estaminais / progenitoras neurais em desenvolvimento normal e doença ^{31, 45, 46, 47.} Aqui, descrevemos um ensaio baseado em neuroesfera para a cultura de células estaminais / progenitoras neuronais e para a diferenciação em neurónios / glia. Nós particularmente enfatizar o tráfico de sinalização componentes aos cílios de estaminal neuronal / células progenitoras e neurónios diferenciados (Figura 1). Em oposição a cultura de neurónios primários, neuroesferas primárias são relativamente fáceis de cultura, são passíveis de várias passagens e congelamento-descongelamento ciclos, e pode ser submetida a diferenciação em neurónios / glia. Importante, determinou-se que neural derivada-neuroesferaas células estaminais / progenitoras e neurónios diferenciados são ciliadas em cultura e localizar moléculas de sinalização importantes para a função ciliar nestes compartimentos. métodos de cultivo baseadas em Neurosphere pode servir como um sistema modelo ideal para estudar ciliogênese e ciliar tráfico de NSC e neurônios diferenciados.