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Developmental Biology

Mit dem Hauptneurosphäre Kulturen Primäre Cilia zu studieren

Published: April 14, 2017
doi:
10.3791/55315
, , ,
1Department of Cell Biology,University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

Das primäre cilium ist von fundamentaler Bedeutung in neuralen Vorläuferzellproliferation, die neuronale Differenzierung, und adulten neuronalen Funktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren ciliogenesis und den Handel mit Signalproteinen zu Zilien in neuralen Stamm- / Progenitorzellen und differenzieren Neuronen unter Verwendung von primären Kulturen Neurosphäre zu studieren.

Abstract

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Introduction

Das primäre cilium ist ein Mikrotubulus-basierte dynamischer subzellulären Kompartiment, das als sensorische Antenne in zellulären Signalweg koordinierenden, einschließlich der Sonic Hedgehog (Shh) -Weg während der embryonalen neuronalen Entwicklung 1, 2 und compartmentalized subzellulären Signalgebung in adulten neuronalen Funktion 3, 4 . Signalisierungs Komponenten dieser Wege, wie der Shh – Rezeptor 5 Patched; der Weg Aktivator Smoothened (Smo) 6; und Gpr161 7 ein Orphan – G – Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) , die sich negativ auf die Shh – Weg reguliert, lokalisieren Zilien in einer dynamischen Art und Weise. Multiple GPCRs wurde auf die Zilien in Neuronen im Gehirn 7, 8, 9, 10 lokalisieren berichtet </sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defekte in Cilien und Zilien generierte Signalwege beeinflussen multiple Gewebe und werden als Ziliopathien 17, 18, 19 gemeinsam bekannt. Das Ziliopathie Krankheitsspektrum umfasst häufig die Entwicklung des Nervenstörung, wie kraniofazialen Anomalien 20, 21, 22. Außerdem regulieren primären Zilien in hypothalamischen Neuronen zentralen Sättigungswege und führen Defekte in 23 zentrale Fettleibigkeit, Übergewicht in syndromic Ziliopathien wie Bardet Biedel Syndrom 24 Spiegelung. Zusätzlich Signalisierungsneuropeptid-Rezeptor in Cilien reguliert central Sättigungsweg 11, 14. Ciliary Lokalisierung von Adenylylcyclase III (ACIII) und GPCRs wie Somatostatin – Rezeptor 3 in Hippokampus – Neuronen führt in neuartigen Objekterkennungsfehlern und Gedächtnisdefiziten 25, 26 und verläuft parallel einen Mangel an Integrität ciliary 27. Die Entwicklungsaspekte der Zilien-generated-Signalisierung sind eng mit Gewebshomöostase gebunden; insbesondere sind Zilien wichtig für die Progression von Shh-Subtyp Medulloblastom aus Granulat Vorläufern im Cerebellum 28, 29 entstehen. So spielen primäre Zilien eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, nach der Geburt, und adulter neuronaler Entwicklung und Funktion.

Neuronale Stammzellen (NSC) befinden sich in der Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel, die Subgranularzone des Gyrus dentatus des Hippocampus und derventrikulären Zone des dritten Ventrikels im Hypothalamus bei Säugetieren 30, 31, 32. NSCs sind multipotent , besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind wichtig für die Entwicklung des Gehirns und der regenerativen Medizin 30. Die meisten NSC in dem SVZ sind ruhende und besitzen ein einsames primäres cilium , die, in vielen Fällen 33 an den lateralen Ventrikel erstreckt. Die primären cilium Signale über die Lokalisierung der verschiedenen Rezeptoren, nachgeschaltete zelluläre Antworten zu induzieren, insbesondere in Bezug auf Shh, TGFß, und Rezeptor – Tyrosin – Kinase – Wege 2, 34, 35, 36. Da primäre Zilien in die lateralen Ventrikel erstrecken, wird die Hypothese aufgestellt , dass die primären Zilien Cytokine in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) erfassen , 37 zu aktivieren NSC </sup>. Neuere Studien legen nahe , dass der Shh – Signalweg und primäre Zilien sind entscheidend für die Aktivierung von Stammzellen bei der Reparatur und Regeneration von mehreren Geweben, einschließlich dem Riechepithel, Lunge, Niere und 38, 39, 40, 41. Jedoch kommuniziert die Mechanismen, durch die CSF mit NSC und ob primäre Zilien beteiligt sind, sind nicht bekannt. Adhärenten NSCs in Kultur sind bewimpert; Shh Stoffwechselweg Komponenten wie Smo und Gpr161 in Cilien lokalisieren; und Shh reaktions 42. Somit kann NSC als wichtiges Modellsystem dienen der Shh Stoffwechselweg, ciliary Handel und neuronalen Differenzierungswege zu untersuchen. Darüber hinaus von NSCs differenzierten Neuronen können auch für ciliare Handels-Assays verwendet werden.

Neurosphären werden von Clustern von frei schwebenden Zellen gebildet aus der Proliferation von NEURA ergebendenl Stammzellen / Vorläuferzellen , die in Anwesenheit von spezifischen Wachstumsfaktoren und nicht klebender Oberflächen 43, 44 wachsen. Neurospheres dient in vitro Kulturmodellen als wichtiges neuralen Stamm- / Vorläuferzellen in der normalen Entwicklung und Krankheit 31, 45, 46, 47 zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Neurosphäre basierende Assay zur Kultivierung von neuralen Stamm- / Vorläuferzellen und zur Differenzierung zu Neuronen / Glia. Wir betonen , insbesondere den Handel mit Komponenten Zilien neuraler Stammzellen / Vorläuferzellen und differenziert Neuronen (Figur 1) signalisiert. Im Gegensatz zu primären Neuronen Kulti, sind primäre Neurosphären relativ leicht zu Kultur, zugänglich sind, um mehrere Durchgänge und Gefrier-Auftau-Zyklen, und die Differenzierung zu Neuronen / Glia eingehen können. Wichtig ist, stellten wir fest, dass die Neurosphäre abgeleiteten neuralenStamm- / Progenitorzellen und differenzierte Neuronen in Kultur bewimpert und lokalisieren Moleküle relevant Zilienfunktion in diesen Kompartimenten Signalisierung. Neurosphere Basis Kultivierungsverfahren kann als ein ideales Modellsystem dienen zur Untersuchung von ciliogenesis und ciliare Handel in NSCs und differenzierten Neuronen.

Protocol

1. Isolierung von Neurosphären aus der erwachsenen Maus-Gehirn Euthanize einen erwachsenen Maus (etwa 2 Monate alt) durch eine Überdosis Isofluran. Doppelklicken Sie sicher, dass die Maus Atmung und seziert unmittelbar nach dem Tod gestoppt hat. Mit einer Schere, machen Sie einen Mittellinienschnitt, den Schädel zu öffnen. Entfernen Sie das Gehirn. Legen Sie das Gehirn in kaltem PBS in einer 10 cm Schale auf Eis. Folgen Sie der whole-mount Dissektion Methode 48 …

Representative Results

Die Zellen aus dem SVZ in NSC – Medium für eine Woche nach dem Plattieren floating Neurosphären wurden (2A) beobachtet. Die Größen der Kugeln variiert zwischen 50 und 200 um. Um zu untersuchen, ob die Kugeln aus neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen abgeleitet wurden, wurden die Neurospheres ausplattiert PLL- und Laminin-beschichtete Deckgläser in NSC-Medium für 2 Tage. Sie wurden dann immunhistochemisch gegen die neuralen Stammzellen / Vorläuferzellmarker, Nest…

Discussion

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung und Neurosphere Kulturen von adulten Maus SVZ zu halten. Einige relevanten Punkte, die Kulturen in Bezug auf sind wie folgt. Erstens sind die Größen der Kugeln typischerweise zwischen 50 bis 200 & mgr; m. Unserer Erfahrung nach, wenn ein Neurosphere größer als 300 & mgr; m im Durchmesser bekommt, hat die optimale Zeit für Passagierung verfehlt. Diese größeren Kugeln enthalten tote Zellen im Kern. Zweitens, wie Neurosphären üblicherweise verwendet werden, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Work in S.M.’s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

Materials

12 mm round cover glass Fisherbrand 12-545-80 
24 well plate Falcon 353047
4 % paraformaldehyde Affymetrix 19943
50 ml tube Falcon 352098
95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid Fisherbrand FB0875714G 10 cm dish
70 µm cell strainer Falcon 352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 711-545-152 Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody
Arl13B, Clone N295B/66 Neuromab AB_11000053
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504001 B27
Centrifuge Thermo scientific ST 40R
Cryogenic vial Corning 430488
DAPI Sigma D9542-10MG
Deoxyribonuclease I from bovine pancrease Sigma D5025-15KU Dnase I
Dimethyl sulfoxide Sigma D8418-100ML DMSO
Disposable Vinyl Specimen Molds Sakura Tissue-Tek Cryomold 4565 10 mm X 10 mm X 5 mm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10×, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma D1408-500ML PBS
Dumont #5 Forceps Fine science tools 11254-20
FBS  Sigma F9026-500ML
Fluoromount-G solution Southern Biotech 0100-01 mounting solution
GFAP DAKO Z0334
Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate ThermoFisher Scientific A-21127 Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody
Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate ThermoFisher Scientific A-21137 Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody
Gpr161 home made N/A
human bFGF Sigma F0291 FGF
hemocytometer Hausser Scientific 0.100 mm deep improved neubauer
Isothesia Henry Schein NDC 11695-0500-2 Isofluorane
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane Sigma L2020 Laminin
L-Glutamine (200mM) Sigma G7513
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000
Mr. Frosty Nalgene  5100-0036
N-2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17502001 N2
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
OCT compound Sakura Tissue-Tek 4583 OCT
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333-100ML
Poly-L-lysine Sigma P4707
Recombinant human EGF protein, CF R and D systems 236-EG-200 EGF
Scissor Fine science tools 14060-10
Superfrost plus microscope slide Fisher scientific 12-550-15 slides
Triton X Bio-Rad 161-0407
Trypsin-EDTA solution (10X) Sigma T4174-100 Trypsin
COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile Corning 3471 ultra-low binding 6 well plate
β-tubulin III Covance MMS-435P TUJ1
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References

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Shimada, I. S., Badgandi, H., Somatilaka, B. N., Mukhopadhyay, S. Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia. J. Vis. Exp. (122), e55315, doi:10.3791/55315 (2017).
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