Met behulp van Primary neurosfeerculturen om te studeren Primary Cilia

De primaire cilium is een microtubulus gebaseerde dynamische subcellulair compartiment dat functioneert als een zintuiglijke antenne coördinatie cellulaire signaalroutes, zoals de Sonic-hedgehog (Shh) route tijdens de embryonale neuronale ontwikkeling ^{1, 2} en gecompartimenteerde subcellulaire signalering bij volwassen neuronale functie ^{3, 4} . Signaleringscomponenten van deze routes, zoals Shh receptor Patched ^5; het pad activator Smoothened (Smo) ^6; en Gpr161 ^7, wees G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) die negatief reguleert de Shh route, lokaliseren op cilia op een dynamische wijze. Meerdere GPCRs zijn gerapporteerd te lokaliseren aan de cilia van neuronen in de hersenen ^{7, 8, 9, 10} </^{sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Defecten in cilia en trilharen gegenereerde signaalroutes beïnvloeden meerdere weefsels en zijn gezamenlijk bekend als ciliopathieën ^{17, 18, 19.} De ciliopathie ziektespectrum omvat vaak neurologische afwijkingen zoals craniofaciale abnormaliteiten ^{20, 21, 22.} Daarnaast kunnen primaire cilia in neuronen van de hypothalamus regelen centrale verzadiging paden en defecten leiden centrale obesitas ^23, mirroring obesitas bij syndromale ciliopathieën zoals Bardet Biedel syndroom ^24. Bovendien, neuropeptide receptor signalering bij cilia regelt central verzadiging trajecten ^{11, 14.} Ciliaire lokalisatie van adenylylcyclase III (ACIII) en GPCR's zoals somatostatine receptor 3 in hippocampale neuronen leiden tot nieuwe defecten objectherkenning en geheugenstoornissen ^{25, 26} en parallel met een gebrek aan integriteit ciliaire ^27. De ontwikkelingsdoelen aspecten van trilharen-gegenereerde signalering zijn nauw verbonden met weefsel homeostase; met name cilia zijn belangrijk voor de voortgang van Shh-subtype medulloblastomas gevolg van granule voorlopers in het cerebellum ^{28, 29.} Zo primaire cilia een belangrijke rol spelen tijdens de embryonale, postnatale en volwassen neuronale ontwikkeling en functie.

Neurale stamcellen (NSC's) zijn gehuisvest in de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikel, de subgranulaire zone van de dentate gyrus van de hippocampus, enventriculaire zone van het derde ventrikel in de hypothalamus bij zoogdieren ^{30, 31, 32.} NSCs zijn multipotente, bezitten het vermogen tot zelf-vernieuwing, en zijn belangrijk voor de ontwikkeling van de hersenen en regeneratieve geneeskunde ^30. De meeste NSC in de SVZ zijn rust en beschikken over een eenzame primaire cilium dat, in veel gevallen, strekt zich uit naar de laterale ventrikel ^33. De primaire cilium signalen via de lokalisatie van de verschillende receptoren induceren stroomafwaartse cellulaire reacties, met name met betrekking tot Shh, TGFp en receptor tyrosine kinase pathways ^{2, 34, 35, 36.} Aangezien primaire cilia uitstrekken in de laterale ventrikel, wordt verondersteld dat primaire cilia cytokines gedetecteerd in de cerebrospinale vloeistof (CSF) om NSC's ³⁷ activeren </sup>. Recente studies suggereren dat de Shh signaleringsroute en primaire cilia zijn cruciaal voor de activering van stamcellen in de reparatie en regeneratie van meerdere weefsels, waaronder de reukepitheel, longen en nieren ^{38, 39, 40, 41.} Echter, de mechanismen die CSF communiceert met NSC en of primaire cilia zijn betrokken zijn niet bekend. Hechtende NSCs in cultuur worden trilharen; lokaliseren Shh pathway componenten zoals Smo en Gpr161 in trilharen; en zijn Shh responsief ^42. Aldus kan NSC dienen als een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen Shh route, ciliaire handel en neuronale differentiatie paden. Bovendien kunnen neuronen opzichte van NSC ook voor ciliaire handel assays.

Neurospheres zijn samengesteld uit clusters van vrij zwevende cellen die voortvloeien uit de proliferatie van neural stam / progenitorcellen die groeien in de aanwezigheid van specifieke groeifactoren en klevende oppervlakken ^{43, 44.} Neurosferen zijn belangrijke in vitro cultuurmodellen neurale stam / progenitorcellen in de normale ontwikkeling en ziekte ^{31, 45, 46, 47} bestuderen. We beschrijven hier een neurosfeer gebaseerde test voor het kweken van neurale stam / progenitorcellen en differentiatie tot neuronen / glia. Wij benadrukken het bijzonder het transport van signaleringscomponenten op cilia van neurale stam / voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen (Figuur 1). In tegenstelling tot het kweken van primaire neuronen, primaire neurosferen zijn relatief gemakkelijk te kweken, zijn ontvankelijk voor meervoudige passages en vries-dooicycli en kunnen differentiëren tot neuronen / glia. Belangrijker, we vastgesteld dat neurosfeer afgeleide neuralestam / progenitorcellen en gedifferentieerde neuronen zijn trilharen in kweek en te lokaliseren signalerende moleculen trilhaarfunctie in deze compartimenten relevant. Neurosphere-gebaseerde kweekmethoden kan dienen als een ideaal model voor het bestuderen ciliogenese en trilharen handel in NSCs en gedifferentieerde neuronen.