Questo documento descrive un metodo per misurare alloreattività in una popolazione mista di cellule T usando un flusso di imaging citometria.
La misurazione della reattività immunologica agli antigeni del donatore in pazienti sottoposti a trapianto è probabile che sia di fondamentale importanza per la riduzione di successo o la revoca di immunosoppressione. La reazione mista leucociti (MLR), saggi di diluizione limite, e ipersensibilità test trans-vivo di tipo ritardato (DTH) sono stati tutti applicati a questa domanda, ma questi metodi hanno limitato la capacità predittiva e / o significative limitazioni pratiche che riducono la loro utilità. flusso Imaging citometria è una tecnica che combina i poteri quantitativi multiparametriche di citometria a flusso con le funzionalità di imaging di microscopia a fluorescenza. Recentemente abbiamo utilizzato un approccio citometria di flusso imaging per definire la proporzione di cellule T riceventi capaci di formare sinapsi immuni mature con cellule presentanti l'antigene (APC) donatore. Utilizzando un modello di trapianto di cuore del mouse ben caratterizzato, abbiamo dimostrato che la frequenza delle sinapsi del sistema immunitario in vitro tra T-APC Membreventi contatti ane predetti fortemente esito allotrapianto a rifiuto, la tolleranza, e una situazione in cui il trapianto sopravvivenza dipende cellule T regolatrici indotte. La frequenza dei contatti T-APC aumentato con le cellule T da topi durante rigetto acuto e diminuita con cellule T da topi resi insensibile alla alloantigene. L'aggiunta delle cellule T regolatorie al sistema in vitro ridotto prolungati contatti T-APC. Criticamente, questo effetto è stato osservato anche con policlonale umano espanso, naturalmente linfociti T regolatori, che sono noti per controllare il rigetto di tessuti umani in modelli di topo umanizzato. Ulteriore sviluppo di questo approccio può consentire una caratterizzazione più profonda del vano cellule T alloreattive nei pazienti trapiantati. In futuro, sviluppo e valutazione di questo metodo utilizzando cellule umane possono costituire la base per i saggi utilizzati per selezionare i pazienti per immunosoppressione minimizzazione, e può essere utilizzato per misurare l'impatto di tolerogenic terapie nella clinica.
trapianto di organo solido ha trasformato la cura di pazienti con malattie allo stadio terminale del rene, fegato, cuore e polmoni. A causa di disparità di maggiori e minori antigeni di istocompatibilità, tuttavia, trapianti vengono prontamente respinte da cellule riceventi T se non vengono utilizzati farmaci immunosoppressivi. Questi agenti hanno numerosi effetti collaterali, compresi i rischi per il cancro e la disfunzione d'organo. Un importante obiettivo clinico è quindi quello di ridurre la dose di immunosoppressione al livello minimo necessario per evitare rigetto. Questo livello può variare a seconda del grado di attivazione del sistema immunitario innato; il grado di donatore-ricevente alloantigene disadattamento; e le differenze tra pazienti in funzione immunitaria, farmacocinetica, farmacodinamica e.
Purtroppo, i medici trapianto non hanno alcuno strumento per valutare con precisione reattività donatore nei singoli pazienti 1. il mistoreazione leucocitaria (MLR) può rilevare reattività donatore, ma non riesce a prevedere in modo affidabile innesto esito 2, 3. Limitanti saggi di diluizione, ELISPOTs citochine, e il saggio trans-vivo sia misurare una gamma limitata di risposte o non sono pratici segnature 4, 5, 6, 7, 8 profili di espressione .Gene hanno rivelato relative alla tolleranza operativa 9, 10, 11, 12 e rifiuto 13, 14, 15, ma questi non sono sempre generalizzabile nelle popolazioni 16 e può quindi avere un'utilità limitata nei singoli pazienti. analy Sequence-basedses del recettore delle cellule T (TCR) di cellule T nel sangue periferico 17 o proliferando in MLR 18 sono stati anche sviluppati ma richiedono ulteriore convalida.
Concettualmente, sarebbe desiderabile avere un saggio che rileva i primi passi necessari a destinatario attivazione delle cellule T da un antigene donatore. Poiché la coltura di cellule più giorni (come nel MLR) può introdurre artefatti, tale test idealmente non richiedono la misurazione di eventi a valle, come proliferazione o funzione effettrice. Ugualmente, tuttavia, sarebbe anche desiderabile per la prova di dipendere qualche elemento della funzione delle cellule T, poiché valutazioni puramente descrittivo (Ad esempio, TCR sequenziamento) potrebbe non essere in grado di distinguere tra cellule T anergic e funzionali.
Numerosi studi hanno indicato che il contatto prolungato T-APC è necessaria per la formazione di una sinapsi immunitario, che è un primo fondamentalepasso nella risposta delle cellule T 19, 20, 21, 22. Recentemente abbiamo riportato che, durante dinamica nell'imaging time lapse vitro, circa 5 – 10% di topo cellule T CD4 + formano contatti duraturi con cellule ossee allogeniche derivate dal midollo dendritiche (BMDCs) 23. La frequenza di contatto prolungato è aumentata negli animali che hanno respinto un innesto, mentre in topi precedentemente reso tollerante agli stessi antigeni, rimanendo su livelli osservati nei topi untransplanted 23. Interazioni prolungate sono stati ridotti in presenza di destinatario Tregs e aumentato in loro assenza, e abbiamo osservato fenomeni simili utilizzando cellule umane T e cellule dendritiche derivate da monociti allogeniche (MoDCs) 23.
Tuttavia, l'enumerazione di contatti prolungati effettuate in un popolazio policlonale cellule Tn è in termini di tempo e ad alta intensità di manodopera. Abbiamo quindi fatto uso dell'imaging citometria a flusso per esaminare allogenico formazione di sinapsi immunitaria. flusso Imaging incorpora citometria le capacità multiparametriche di acquisizione e analisi dei dati di flusso convenzionale citometria con le capacità di imaging singola cella di microscopia a fluorescenza. Questa tecnica è stata utilizzata da altri ricercatori per studiare la formazione di sinapsi immune dalle cellule T monoclonali 24, 26, 27 o in presenza di superantigeni 28. In questi contesti, tuttavia, la frequenza di cellule T che rispondono varia dal 30-100%, mentre le cellule T alloreattive sono generalmente stimati per rappresentare 5-15% del repertorio totale delle cellule T 29, 30, 31, 32. È importante sottolineare che, abbiamo dimostrato che il flusso di immagini in grado di produrre citometria avery misura comparabile di alloreattive frequenza delle cellule T 23 e che i cambiamenti nella frequenza sinapsi all'interno di una popolazione di cellule T policlonale sono predittivi di innesto 23 risultati. Attualmente, questo approccio è stato ottimizzato per calcolare l'alloreattività diretto delle cellule T CD4 +, ma, in linea di principio, potrebbe anche essere sviluppato per esaminare le cellule T CD8 + e la via indiretta. Alloreattività indiretta si crede di diventare sempre più rilevante in tempi più lunghi post-trapianto 33. Stiamo sviluppando questo metodo per utilizzare cellule umane, che consentirà di testare in pazienti. Così, in futuro, l'approccio generale può essere utile per la valutazione funzionale delle risposte delle cellule T in pazienti trapiantati prima del trapianto; subito dopo il trapianto; e nel lungo termine, quando la droga minimizzazione diventa un obiettivo importante.
Imaging flusso citometria è stato usato per dimostrare la formazione di sinapsi immune tra cellule T e APC monoclonali o in presenza di superantigeni 24, 25, 26, 27, 28. Questo metodo sfrutta il fatto che dopo un cellule T-APC contatto produttivo, la cellula T cambia la sua citoscheletro actina, polarizzando verso il sito di contatto 21. Questo riarrangiamento non avviene senza segnalazione TCR, ed è quindi un correlato precoce di attivazione delle cellule T 19, 20, 21. Il metodo qui presentato si adatta questo approccio alla misurazione della frequenza alloreattive cellule T in policlonali popolazioni di cellule T. Come tale, essa può in futuro servire come base per lo sviluppo di test per reactivi donatore ty nel trapianto clinica.
Anche se i confronti diretti non sono ancora stati fatti, l'individuazione di alloreattive sinapsi immuni sembra avere potere predittivo superiore rispetto alla tradizionale MLR. Ad esempio, lavori precedenti hanno dimostrato che, nel protocollo tolerizing sopra descritto, i risultati di una MLR riescono a correlare in modo affidabile con innesto risultato 2.
Un certo numero di saggi sono stati sviluppati per lo stato operativo tolleranza nell'uomo 9, 10, 11, anche se questi non misurano la funzione delle cellule effettrici in risposta a alloantigene. Al contrario, IFNy ELISPOT Saggi funzione 8 misura effettore cellule T ma non può catturare l'intero spettro di secrezione di citochine che possono essere relativo al rigetto del trapianto acuto e cronico, quali IL-17 38,> 39. Il saggio diluizione limitante 4, che è laborioso, e il saggio trans-vivo 6, che richiede i topi, hanno importanti limitazioni pratiche che impedirebbero la loro applicazione in ambito clinico. Recenti miglioramenti sull'analisi di cellule proliferanti utilizzando TCR analisi della sequenza di cellule T che rispondono in MLR possono essere di valore, ma come il saggio qui presentato, richiedono ulteriore validazione in studi clinici 18, 40.
Ulteriore sviluppo del test di rilevamento sinapsi immunitaria richiederà che un certo numero di questioni importanti rispondere. In primo luogo, il saggio come sviluppato misura solo alloreattività diretta. La via diretta prevede la presentazione di allogenici complessi MHC / peptide su APC donatore-derivati. Queste ultime sono in genere eliminati rapidamente dopo il trapianto, e l'ulteriore presentazione alloantigene è carricato da APC beneficiari presentano intatta donatore MHC (via semi-diretto) o antigeni donatore trasformati in sé MHC (via indiretta). Il percorso indiretto è un importante fattore di rigetto cronico 33, 41.
In linea di principio, dovrebbe essere possibile individuare le sinapsi immuni indiretti da questo test, ma indirettamente alloreattive cellule T hanno una frequenza molto più bassa di quelli diretti 42, 43, il che significa che sarà necessaria l'analisi di un maggior numero di eventi. Una seconda considerazione è che abbiamo testato soltanto questo saggio utilizza cellule T CD4 +, mentre le cellule T CD8 + sono anche una componente importante della risposta anti-donatore. Ancora una volta, dovrebbe essere possibile rilevare sinapsi T CD8 + cellule APC utilizzando questo metodo. Un'altra limitazione è che il metodo richiede l'esame manuale e l'analisi delle immagini cellulari in memb finalecancello contatto rane e stiamo lavorando l'automazione di questa fase.
Infine, il metodo richiede sperimentazione e sviluppo in soggetti umani, e sono attualmente in corso studi preliminari con campioni umani. Ulteriori fenotipica sottoinsieme di analisi delle cellule T (vale a dire, effettrici, la memoria, normativo, ecc) in combinazione con il rilevamento di sinapsi del sistema immunitario nei pazienti trapiantati rappresenterebbe un approccio potente per la caratterizzazione del repertorio delle cellule T alloreattive e sarà un focus importante per lavoro futuro.
The authors have nothing to disclose.
SCJ è stato sostenuto da un'International Society for Heart Lung Transplantation Research Fellowship e un Royal College of Physicians e chirurghi del Canada Detweiler Viaggiare Fellowship.SM stato sostenuto in parte da un'International Society for Heart Lung Transplantation Career Development Award (a SCJ). SS è stato sostenuto dal National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.JH è il destinatario di un rene Research Fellowship UK anziano non clinici. Questo lavoro è stato finanziato dalle seguenti sovvenzioni per AB e KW: un Wellcome Trust Grant Program (082519Z07Z), un British Heart Foundation Grant Program (PG / 10 / 62,28,504 mila), e il programma dell'Unione europea quadro 7 (uno studio; BioDRIM). Gli autori desiderano ringraziare Michael Parsons e il meccanismo di citometria a flusso Nucleo presso l'Istituto di Ricerca Lunenfeld-Tanenbaum, Sinai Health System, Toronto per la fornitura di accesso e il supporto con lo strumento ImageStream Mark X.
Phosphate-buffered saline | Various | Varies | |
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5M solution | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
Triton X-100 nonionic detergent | Sigma-Aldrich | X100 | |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution |
Cell strainers, 70 μm pore size | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Phalloidin-fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P5282 | |
7-aminoactinomycin D | Thermo Fisher Scientific | A1310 | Reconstitute in DMSO |
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2 | eBioscience | 17-0902 | |
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b | eBioscience | 48-0112 | Pacific blue has been replaced by eFluor 450 |
Biotinylated anti-mouse CD3 | eBioscience | 13-0032 | |
Biotinylated anti-mouse MHC class II | eBioscience | 13-5321 | |
Biotinylated anti-mouse B220 | eBioscience | 13-0452 | |
Biotinylated anti-mouse CD8 | eBioscience | 13-0081 | |
Biotinylated anti-mouse CD19 | eBioscience | 13-0193 | |
Anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS magnetic cell separator | MIltenyi Biotec | 130-042-302 | |
recombinant mouse GM-CSF | Peprotech | 315-03 | |
recombinant human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | Human TGFβ1 has activity on mouse cells |
Amnis ImageStream X Mark II | Amnis/EMD Millipore | N/A | Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/ |
IDEAS Software | Amnis/EMD Millipore | N/A | Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20 |
Cell culture medium | Various | Varies | |
Fetal bovine serum | Various | Varies | |
Cell culture plates | Various | Varies |