Развитие<em> Метаргиз анизолия</em> Как Mycoinsecticide: от изоляции до полевых характеристик
Summary
Здесь мы сообщаем о различных этапах разработки основанного на знаниях эффективного микоинсецицита, включая изоляцию, идентификацию, скрининг и подбор «энтеропатогенного гриба« наилучшего соответствия », Metarhizium anisopliae , для борьбы с насекомыми-вредителями в сельском хозяйстве ,
Abstract
Основной проблемой при разработке коммерческих микоинсектицидов является скорость уничтожения по сравнению с химическими инсектицидами. Поэтому важными шагами являются изоляция и скрининг для выбора быстродействующего, сильно вирулентного энтомопатогенного гриба. Энтомопатогенные грибы, такие как Metarhizium, Beauveria и Nomurea , которые действуют при контакте, лучше подходят, чем Bacillus thuringiensis или вирус нуклеополедроза (NPV), которые необходимо принимать внутрь насекомого-вредителя. В настоящей работе мы выделили 68 штаммов Metarhizium от инфицированных насекомых с использованием метода разбавления почвы и приманки. Изоляты были идентифицированы путем амплификации и секвенирования области рДНК ITS1-5.8S-ITS2 и 26S. Наиболее вирулентный штамм Metarhizium anisopliae был выбран на основе медианной летальной концентрации (LC 50 ) и времени (LT 50 ), полученной в биоанализах насекомых, против личинок III-типа Helicoverpa armigera.Массовое производство спор по выбранному штамму проводили с твердофазной ферментацией (SSF) с использованием риса в качестве субстрата в течение 14 дней. Споры экстрагировали из спорулированной биомассы с использованием 0,1% твин-80 и получали различные составы спор. Полевые испытания составов для борьбы с заражением H. armigera в голубем были проведены рандомизированным блочным дизайном. Уровни контроля заражения, полученные с маслом и водными составами (78,0% и 70,9% соответственно), были лучше, чем 63,4%, полученные химическим пестицидом.
Introduction
С введением хлорорганических пестицидов в 1940 – х годах в Индии, использование пестицидов увеличилось во много раз 1, с урожая вредители все еще обходится в миллиарды рупий 2 в год с точки зрения потери урожая в сельскохозяйственном производстве. Широкое и неразумное использование синтетических пестицидов является постоянной угрозой для окружающей среды и здоровья человека 1 . Неизбирательное использование пестицидов приводит к остаткам в почве и истощению природных хищников-вредителей. Он также служит мощным давлением отбора для изменения генетического состава популяции вредителей, что приводит к развитию резистентности 1 . Несмотря на огромные преимущества «зеленой революции», требующей больших затрат, таких как удобрения и пестициды, вредители продолжают оставаться основным биотическим ограничением. Общая оценка зарегистрированных ежегодных потерь урожая в Индии и во всем мире составляет 12 млрд. Долл. СШАEf "> 2 и 2 000 млрд. Долл. США 3 соответственно.
Когда химические пестициды оказывают вредное воздействие при использовании для борьбы с насекомыми-вредителями, необходимо искать альтернативные методы, которые являются экологически безопасными, надежными, экономичными и устойчивыми. Биологический контроль предлагает подходящую альтернативу и включает использование паразитов, хищников и микробных патогенов 4 . Известно, что грибы заражают широкий круг насекомых-вредителей, включая чешуекрылых, перепончатокрылых, колеоптеров и диптерин, часто приводящих к естественным эпизоотиям. Кроме того, в отличие от других бактериальных и вирусных средств борьбы с насекомыми, способ действия патогенных грибов насекомых находится в контакте 5 . Эти грибы содержат гетерогенную группу из более чем 100 родов, из которых около 750 видов относятся к различным насекомым. Важными грибковыми патогенами являются: Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii и Hirsutella sp., Чтобы назвать несколько 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Сорокин является вторым наиболее широко используемым энтомопатогенным грибом в биоконтролле. Известно, что он атаковал более 200 видов насекомых 7 .
В этом исследовании представлены различные этапы, связанные с основанием на знаниях развития микопауцида с использованием M. anisopliae . Это включает в себя: 1) идентификацию источника ( т. Е. Почв или насекомых-мицеров) для вирулентных энтомопатогенов, 2) идентификацию и селекцию энтомопатогена, 3) стратегии сохранения их вирулентного характера и эффективности в лабораторном биоанализе и на местах 4 ) Рентабельная формулировка инфекционных размножений, 5) разработка уникальных параметров контроля качества для вирулентного препарата и 6) биоразведка и добавление стоимости.
Protocol
Representative Results
Discussion
В 1880-х годах была сделана первая попытка использовать Metarhizium для борьбы с жуком-скарабеем Anisoplia austriaca и куркулией сахарной свеклы Cleonis punctiventris 21 . В этом протоколе одним из предварительных условий было выделение вирулентного штамма либо из почвы, либо и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают вклад сотрудников из программы Индо-швейцарского сотрудничества в области биотехнологии (ISCB) Департамента биотехнологии, Дели и Швейцарского агентства по развитию и сотрудничеству, Берн, Швейцария. Признаны вклад студентов и сотрудников проекта, участвующих в разработке микоинсектицидов, в том числе Вандана Гормаде, Паллави Нахар, Прия Ядав, Шуклангби Кулкарни, Маниша Капур, Сантош Чаван, Равиндра Видхате, Шамала Мане и Абхиджит Ланде. EKP и SGT выражают благодарность Комиссии университетов по грантам, Индии и Совету научных и промышленных исследований (CSIR), соответственно, за научные стипендии. МВД признает поддержку Совета промышленных и научных исследований, Нью-Дели для программы «Заслуженный ученый». Авторы благодарны Департаменту биотехнологии, Нью-Дели, Индия за финансовую поддержку в рамках программ ISCB и SBIRI. Мы благодарныРецензентов за их вклад.
Materials
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G., Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. , 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A., Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. , 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., MV, D. e. s. h. p. a. n. d. e., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi – a valuable alternative to fight against insect pests. , 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E., Leathan, G. F. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. , 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D., Lacey, L. A. . Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. , 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., Innis, M. A. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. , 315-322 (1990).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. . Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. . Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G., Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. , 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
