Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler<sup> +</sup> Pankreas Progenitörler
Summary
Burada in vitro NKX6-1 + pankreas atalarıdır insan embriyonik kök hücreleri ayırt etmek için 4 aşamalı bir protokol açıklar. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre hatları çeşitli uygulanabilir.
Abstract
Pluripotent kök hücreleri, kendine yenilemek ve bunların çalışma ve diyabet gelecekteki tedavisi için kullanılabilir pankreatik progenitör hücrelerinin üretimi için cazip bir kaynak yapma, birden fazla soy ayırt yeteneğine sahiptir. Bu makale, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) pankreas progenitör hücreleri üretmek için tasarlanmış bir dört aşamalı farklılaşma protokolü özetliyor. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre (hPSC) hatları, bir dizi uygulanabilir. pankreatik progenitör hücreleri üretmek için alınan yaklaşım doğru pankreas gelişiminin temel aşamaları modellemek için hESC ayırt etmektir. Bu Aktivin A, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve CHIR990210 mevcudiyetinde hücrelerin kültürlenmesi ile elde edilir kesin endoderm, indüksiyonu ile başlar. Fibroblast Büyüme Faktörü 10 (FGF10) ve Dorsomorphin ile daha fazla farklılaşma ve desenlendirme arka foregut benzeyen hücreler üretir. Retin eklenmesioik asit, noggin, SANT-1 ve FGF10 pankreas endoderm karakteristik hücrelerine arka foregut hücreleri ayırır. Son olarak, epidermal büyüme faktörü (EGF) kombinasyonu, nikotinamid ve Noggin PDX1 + / NKX6-1 + hücreleri etkin bir şekilde oluşmasına sebep olur. Akım sitometri pankreas gelişimin temel aşamalarında spesifik belirteçler ifadesini teyit etmek için yapılır. Evre 4 sonunda PDX1 + / NKX6-1 + pankreas progenitörler bağışıklık yetersizliği olan farelere transplantasyonu sırasında olgun β hücreleri üretme yeteneğine sahiptir ve daha fazla in vitro insülin üreten hücreleri üretmek için ayırt edilebilir. Böylece, PDX1 verimli nesil + / NKX6-1 + pankreas ataları, bu protokolde gösterdiği gibi, bu in vitro insan pankreas gelişimini incelemek için bir platform sağlar olarak büyük önem taşımaktadır ve farklılaşma potansiyeli olan hücre kaynağı sağlar EV olabilir β hücrelerientually diyabet tedavisi için kullanılabilir.
Introduction
Diyabet prevalansı artmakta ve Kanada Diyabet Derneği göre, tip 1 diyabet (T1D) 1 olan bu bireylerin% 5-10 ile, Kanada'da 11 milyon kişi diyabet ya da prediyabetik olduğu tahmin edilmektedir. T1D'nin Langerhans adacıklarında içinde bulunan insülin üreten β hücrelerinin yok neden olduğu bir otoimmün hastalıktır. Şu anda, T1D ile yaşayan bireylerin insülin 2 eksojen kaynakları gerektirir. insülin tedavisi gelişmelere rağmen, T1D hastalarının kan şekeri düzenleyen zor bir zaman var ve hipo ve hiperglisemi hem acı çekmeye devam devam ediyor. Bir tedavi umut verici şekilde, tip 1 diyabetin bölgesindeki normogliseminin in vivo ve in vitro 3 hem β hücreleri üretmek insülin sınırsız kaynağı oluşturmak için kullanılabilecek insan embriyonik kök hücreleri (hESC) kullanılmasıdır geri <sclass = "xref"> 4, 5, 6, 7 kadar. HESC Farklılaşan ß-benzeri hücreler mümkün tip 2 diyabet için yeni tedavi hedeflerinin belirlenmesi için izin in vitro diyabet eğitim ve T1D'nin hastalara transplantasyon için hücrelerin sağlamak için yapabiliriz.
In vitro hESC insülin üreten hücrelerin üretilmesi en başarılı girişim pankreas gelişimi 4, 5 sırasında meydana gelen embriyonik olayları özetlemek etmektir. Bu doğru gelişen pankreas kilit aşamaları modellemek için farklı sinyal yollarının manipülasyonu içerir. Pankreas gelişimi CXCR4 ve CD117 (c-kit) 8, 9 sentezlenmesi ile karakterize kesin endoderm, indüksiyonu ile başlar. definit kesin düzenlemeive endoderm organizasyonu daha sonra ön-arka ve ventral-dorsal desenlendirme uğrar bağırsak tüpü, oluşumu için gereklidir. Dorsal ve ventral pankreas tomurcukları pankreas gelişimi 10 için gerekli olan pankreas ve duodenum homeobox geni (Pdx1), ifade arka foregut bölgesinden çıkmaktadır. Dorsal ve ventral tomurcukları sigorta ardından geniş epitel biçimlenme ve genişleme 11 uğrar pankreası oluşturmak için. Endokrin ve ekzokrin soy bağlılık ifade eden multipotent progenitör hücreleri (MPCs) üretimi eşlik eder, diğerlerinin yanı sıra, transkripsiyon Pdx1, Nkx6.1 ve Ptf1a 12, 13 faktörleri. Endokrin ve duktal hücreleri olacak MPCs Ptf1a ifadesini düşürürken Nkx6-1 ifade etmeye devam. Bunun aksine, ekzokrin kökenli hücreler expressio kaybedersinizNkx6-1 N ve Ptf1a ifade 12 korur.
Transkripsiyon faktörü Nkx6-1, özellikle hücre kaynaşmasına karşı endokrin progenitör hücrelerin farklılaşması sırasında, pankreas gelişiminde önemli bir rol oynar. Daha önce pankreas gelişimi 14 sırasında β hücrelerinin bozulmuş oluşumuna Nkx6-1 sonuçları, silme açıklandığı gibi,. Bu nedenle, in vitro ve in vivo olarak ensülin üreten β hücrelerin üretilmesi Nkx6-1 etkin indüksiyon gerektirir.
Biz son zamanlarda verimli hPSCs gelen PDX1 + / NKX6-1 + pankreas atalarıdır üretmek için bir protokol geliştirmiştir. Bu hPSC türetilen pankreas ataları bağışıklık yetersizliği olan farelere 3 transplantasyon sırasında olgun β hücreleri oluşturur. 1) kesin endoderm indüksiyon: farklılaşma protokolü 4 ayrılabilir karakteristik aşamaları2) arka foregut desenleme, 3) pankreas şartname ve 4) NKX6-1 indüksiyon. Burada yönettiği farklılaşma her adımı ayrıntılı bir açıklama sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarıyla in vitro hPSCs gelen NKX6-1 + pankreas progenitörlerin üreten pankreatik gelişimi sırasında önemli gelişim aşamaları yöneten belirli bir sinyal yollarının doğru düzenlenmesini kapsayan hPSCs yüksek kalitede kültürleri ve yönlendirilmiş farklılaşma kullanımına dayanır. Daha önce aşağıdaki hususlar yapılmalıdır etkin NKX6-1 üretimi sağlamak için, 3 gösterildiği gibi bu protokol hPSC hatlarının çeşitli çapında NKX6-1 sağlam e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazının Toronto Genel ve Batı Vakfı ve Banting ve En İyi Diyabet Merkezi-Üniversite Sağlık Ağı Lisans Ödülü fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
