בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup> +</sup> אבות הלבלב
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול 4 שלבים להבדיל מתאי גזע עובריים אנושיים כדי NKX6-1 + אבות לבלב במבחנה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של שורות תאי גזע אנושיים pluripotent.
Abstract
יש תאי גזע פלוריפוטנטיים היכולת עצמית לחדש ולבדל שושלות מרובות, מה שהופך אותם מקור אטרקטיבי עבור הדור של ובתאים לבלב שיכול לשמש לחקר וטיפול עתיד של סוכרת. מאמר זה מתאר פרוטוקול בידול ארבעה שלבים שנועד ליצור ובתאי לבלב מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs). פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מספר תאי הגזע האנושי פלוריפוטנטיים קווי (hPSC). הגישה שננקטה כדי ליצור ובתאי לבלב היא להבדיל hESCs לבנות מודל מדויק בשלבים קריטיים התפתחות לבלב. זה מתחיל עם האינדוקציה של האנדודרם הסופי, אשר מושג על ידי culturing תא בנוכחות Activin A, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) ו CHIR990210. בידול דפוסים בהמשך עם פיברובלסטים Growth Factor 10 (FGF10) ו Dorsomorphin מייצרים תאים דומים במעי הקדמי האחורי. התוספת של ברטיןOIC חומצה, שהגולגולת, SANT-1 ו FGF10 מבדיל תאים במעי הקדמי האחורי לתאים אופייני endoderm הלבלב. לבסוף, השילוב של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), Nicotinamide ו noggin מוביל הדור יעיל של PDX1 + / NKX6-1 + תאים. Cytometry זרימה מבוצע כדי לאשר את הביטוי של סמנים ספציפיים בשלבים המפתח של התפתחות הלבלב. PDX1 + / NKX6-1 + אבות הלבלב בסוף השלב 4 מסוגלים לייצר תאי β בוגרים על השתלה לעכברי immunodeficient ויכולים להיות מובחן נוסף לייצר תאים מייצרי אינסולין במבחנה. לפיכך, הדור היעיל של PDX1 + / NKX6-1 + אבות לבלב, כפי שמודגם בפרוטוקול זה, הוא בעלת חשיבות רבה כיוון שהיא מספקת פלטפורמה ללמוד פיתוח לבלב אנושי במבחנה מספקת מקור של תאים עם הפוטנציאל של הבחנה כדי תאי β שיכול EVentually לשמש לטיפול בסוכרת.
Introduction
השכיחות של סוכרת היא הגדילה על פי איגוד הסוכרת הקנדי, ההערכה היא כי למעלה מ -11 מיליון בני אדם בקנדה הוא סוכרת או prediabetic, עם 5-10% של אנשים אלה שיש סוכרת סוג 1 (T1D) 1. T1D היא מחלה אוטואימונית אשר נגרמת על ידי הרס של תאי β לייצר אינסולין אשר ממוקמים בתוך איי לנגרהנס. נכון לעכשיו, אנשים החיים עם T1D דורשים מקורות חיצוניים של אינסולין 2. למרות ההתקדמות בטיפול אינסולין, חולי T1D ממשיכים מתקשים לווסת את רמות הסוכר בדם שלהם ממשיכים לסבול הן חָסֵר ו היפרגליקמיה. טופס מבטיח טיפול לשחזר normoglycemia ב T1D הוא השימוש בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), אשר יכול לשמש כדי ליצור אספקה בלתי מוגבלת של תאים המייצרים אינסולין β הוא in vivo ו במבחנה 3, <sעד class = "Xref"> 4, 5, 6, 7. ההתמיינות hESCs כדי בטא דמויי תאים יכול לעשות את זה ניתן ללמוד סוכרת במבחנה, המאפשר זיהוי של מטרות טיפוליות חדשות לטיפול בסוכרת מסוג 2 ולספק תאים להשתלה לחולים T1D.
הניסיון המוצלח ביותר ביצירת תאים מייצרי אינסולין hESCs במבחנה היא לשחזר את האירועים עובריים המתרחשות במהלך התפתחות הלבלב 4, 5. זה כרוך המניפולציה של מסלולי איתות מובהקים מודל שלבי מפתח מדויק של הלבלב מתפתח. פיתוח לבלב מתחיל עם האינדוקציה של האנדודרם הסופי, אשר מאופיין על ידי הביטוי של CXCR4 ו CD117 (c-KIT) 8, 9. תקנה מדויקת של definitארגון endoderm ive נדרש להקמת צינור הבטן, אשר לאחר מכן עובר קדמי אל אחוריים ואת גחון-הגבה דפוסים. הגבה וניצני לבלב גחון לצאת מהאזור במעי הקדמי האחורי המבטא את גן homeobox לבלב תריסריון (Pdx1), אשר הוא הכרחי עבור התפתחות לבלב 10. הגבה וניצני גחון פתיל כדי ליצור את הלבלב, אשר לאחר מכן עובר שיפוץ נרחב אפיתל והרחבה 11. מחויבות השושלת האנדוקרינית אקסוקרינית מלווה דור ובתאים מולטיפוטנטיים (MPCs) המבטאים, בין היתר, את שעתוק גורמי Pdx1, Nkx6.1 ו Ptf1a 12, 13. MPCs שיהפכו תאי האנדוקרינית ductal ממשיך להביע Nkx6-1 תוך הפחתת ביטוי Ptf1a. בניגוד לכך, תאי שושלת אקסוקרינית יאבדו expression של Nkx6-1 ולתחזק Ptf1a הביטוי 12.
גורם השכפול Nkx6-1 יש תפקיד מרכזי בפיתוח לבלב, בפרט במהלך ההתמיינות של תאי אב האנדוקרינית כדי בטאו תאים. כפי שתואר קודם לכן, המחיקה של תוצאות Nkx6-1 במבנה לקוי של תאי β במהלך התפתחות הלבלב 14. לכן, יצירת תאי β מייצר אינסולין הוא במבחנת in vivo דורשת האינדוקציה היעילה של Nkx6-1.
אנחנו לאחרונה פתחנו פרוטוקול ביעילות ליצור PDX1 + / NKX6-1 + אבות לבלב מ hPSCs. HPSC נגזרים אלה אבות לבלב לייצר תאי β בוגרים על השתלה לעכברי immunodeficient 3. פרוטוקול הבידול ניתן לחלק 4 שלבים אופייניים: 1) אינדוקציה האנדודרם סופית, 2) דפוסים במעי הקדמי האחורי, 3) מפרט הלבלב ו -4) אינדוקציה NKX6-1. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של כל שלב של התמיינות מכוונת.
Protocol
Representative Results
Discussion
יצירה בהצלחה NKX6-1 + אבות לבלב מ hPSCs במבחנה מסתמכת על השימוש של תרבויות באיכות גבוהות של hPSCs והבחנה מכוון מעורבות בוויסות המדויקת של מסלולי איתות ספציפיים ששולטים שלבי התפתחות מפתח במהלך התפתחות לבלב. למרות פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לגרום ביטוי חזק של NKX6-1 פני…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כתב היד זו נתמכה על ידי מימון כללי בטורונטו קרן המערבי בנטינג & Best סוכרת מרכז-אוניברסיטת בריאות רשת בוגר פרס.
Materials
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
