التمايز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة لNKX6-1<sup> +</sup> البنكرياس أسلاف
Summary
نحن هنا وصف بروتوكول 4-مرحلة لتمييز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لNKX6-1 + الأسلاف البنكرياس في المختبر. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لمجموعة متنوعة من خطوط الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان.
Abstract
الخلايا الجذعية المحفزة لديها القدرة على الذات تجديد وتميز لأنساب متعددة، مما يجعلها مصدرا جذابا لتوليد الخلايا الاولية البنكرياس التي يمكن استخدامها لدراسة والعلاج في المستقبل من مرض السكري. توضح هذه المقالة بروتوكول التمايز أربع مراحل مصممة لتوليد الخلايا الاولية البنكرياس من خلايا جذعية جنينية بشرية (hESCs). ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى عدد من خطوط الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSC). النهج المتبع لتوليد الخلايا الاولية البنكرياس هو التفريق hESCs لنموذج بدقة المراحل الأساسية للتنمية البنكرياس. هذا الأمر يبدأ تحريض الأديم الباطن نهائي، الذي يتحقق من خلال زراعة الخلايا في وجود Activin A، الخلايا الليفية عامل النمو الأساسي (bFGF) وCHIR990210. مزيد من التمايز والزخرفة مع عامل الخلايا الليفية النمو 10 (FGF10) وDorsomorphin يولد خلايا تشبه المعى الأمامي الخلفي. إضافة ريتينحمض منظمة المؤتمر الإسلامي، رأس، سان-1 وFGF10 يميز خلايا الخلفي المعى الأمامي إلى خلايا مميزة من الأديم البنكرياس. وأخيرا، فإن الجمع بين عامل نمو البشرة (EGF)، نيكوتيناميد ورأس يؤدي إلى توليد كفاءة PDX1 + / + NKX6-1 الخلايا. التدفق الخلوي يتم تنفيذه لتأكيد التعبير عن علامات معينة في مراحل رئيسية من تطوير البنكرياس. وPDX1 + / + NKX6-1 الأسلاف البنكرياس في نهاية المرحلة 4 هي قادرة على توليد خلايا β الناضجة على زرع في الفئران العوز المناعي ويمكن زيادة متباينة على توليد خلايا منتجة للأنسولين في المختبر. وبالتالي، فإن الجيل كفاءة PDX1 + / + NKX6-1 الأسلاف البنكرياس، كما هو موضح في هذا البروتوكول، أهمية كبيرة، حيث أنه يوفر منبرا لدراسة تطوير البنكرياس البشرية في المختبر، ويوفر مصدرا للخلايا مع إمكانية التفريق ل خلايا بيتا التي يمكن أن EVentually أن تستخدم لعلاج مرض السكري.
Introduction
انتشار مرض السكري في تزايد وفقا للجمعية الكندية للسكري، تشير التقديرات إلى أن أكثر من 11 مليون شخص في كندا والسكري أو prediabetic، مع 5-10٪ من هؤلاء الأفراد جود مرض السكري نوع 1 (T1D) 1. T1D هو أحد أمراض المناعة الذاتية التي يسببها تدمير خلايا بيتا المنتجة للأنسولين التي تقع ضمن جزر لانجرهانز. حاليا، والأفراد الذين يعيشون مع T1D تتطلب مصادر خارجية للأنسولين 2. على الرغم من التقدم في العلاج بالأنسولين، يستمر المرضى T1D لديهم الوقت الصعب تنظيم مستويات الجلوكوز في الدم وما زالت تعاني على حد سواء تحت؛ دون وارتفاع السكر في الدم. نموذج واعد للعلاج لاستعادة سوائية سكر الدم في T1D هو استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs)، والتي يمكن استخدامها لتوليد امدادات غير محدودة من الانسولين إنتاج خلايا بيتا على حد سواء في المجراة في المختبر 3، <sحتى الطبقة = "XREF"> 4، 5، 6، 7. التفريق hESCs إلى بيتا تشبه الخلايا يمكن أن يجعل من الممكن لدراسة مرض السكري في المختبر، والسماح لتحديد أهداف علاجية جديدة لمرض السكري من النوع 2، وتوفير الخلايا للزرع في المرضى T1D.
المحاولة الأكثر نجاحا في توليد خلايا منتجة للأنسولين من hESCs في المختبر هي تلخيص للأحداث الجنينية التي تحدث أثناء تطور البنكرياس 4، 5. وهذا ينطوي على تلاعب من مسارات إشارات واضحة لنموذج بدقة المراحل الأساسية من البنكرياس النامية. تبدأ تطوير البنكرياس مع تحريض من الأديم الباطن نهائي، الذي يتميز التعبير عن CXCR4 وCD117 (ج-KIT) 8، 9. التنظيم الدقيق للdefinitمطلوب منظمة الأديم إيف لتشكيل الأنبوب امعاء، والتي يخضع آنذاك الأمامي إلى الخلفي الزخرفة والبطنية الظهرية. ظهري وبطني براعم البنكرياس الخروج من منطقة المعى الأمامي الخلفي الذي يعبر عن البنكرياس والاثنى عشر علبة مثلية الجين (Pdx1)، وهو أمر ضروري لتطوير البنكرياس 10. ظهري وبطني براعم الصمامات لتشكيل البنكرياس، والذي يخضع لثم إعادة الظهارية واسعة النطاق والتوسع 11. ويرافق الالتزام الغدد الصماء وخارجية الإفراز النسب من قبل جيل من الخلايا الاصلية متعددة القدرات (البلدان المتوسطية الشريكة) أن أعرب، من بين أمور أخرى، والنسخ عوامل Pdx1، Nkx6.1 وPtf1a 12 و 13. البلدان المتوسطية الشريكة التي ستصبح الغدد الصماء والأقنية الخلايا تستمر في التعبير عن Nkx6-1 بينما تتناقص التعبير Ptf1a. وخلافا لذلك، فإن الخلايا الإفرازية النسب تفقد expressioن من Nkx6-1 والحفاظ على Ptf1a التعبير 12.
عامل النسخ Nkx6-1 دورا رئيسيا في تطوير البنكرياس، ولا سيما خلال تمايز الخلايا الاصلية الغدد الصماء لبيتا الخلايا. كما هو موضح سابقا، حذف النتائج Nkx6-1 في تشكيل ضعف الخلايا β خلال تطوير البنكرياس 14. لذلك، وتوليد خلايا بيتا المنتجة للأنسولين في كل من المختبر والمجراة يتطلب تحريض كفاءة Nkx6-1.
نحن وضعت مؤخرا على بروتوكول لتوليد بكفاءة PDX1 + / + NKX6-1 الأسلاف البنكرياس من hPSCs. هذه الأسلاف البنكرياس المستمدة hPSC-توليد خلايا β الناضجة على زرع في الفئران العوز المناعي 3. ويمكن تقسيم بروتوكول التمايز في 4 مراحل من سمات: 1) الاستقراء الأديم الباطن نهائي2) الزخرفة الخلفي المعى الأمامي، 3) مواصفات البنكرياس و4) الحث NKX6-1. هنا نقدم وصفا مفصلا لكل خطوة من التمايز الموجهة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توليد بنجاح NKX6-1 + الأسلاف البنكرياس من hPSCs في المختبر يعتمد على استخدام الثقافات جودة عالية من hPSCs والتمايز الموجهة على التنظيم الدقيق لمسارات الإشارات المحددة التي تحكم مراحل النمو الرئيسية خلال تطوير البنكرياس. على الرغم من أن هذا البروتوكول يمكن أن تست?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا المخطوط من خلال تمويل من تورونتو العام ومؤسسة الغربية وجائزة الدراسات العليا شبكة الصحة بانتينغ وأفضل للسكري مركز الجامعي.
Materials
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
