Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Ibrahim B. Durowoju; Kamaljit S. Bhandal; Jian Hu; Bruce Carpick; Marina Kirkitadze

doi:10.3791/55262

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Biochemistry

시차 주사 열량 - 단백질 항원의 열 안정성과 형태를 평가하기위한 방법

Published: March 04, 2017

doi:

10.3791/55262

Ibrahim B. Durowoju¹, Kamaljit S. Bhandal¹, Jian Hu¹, Bruce Carpick¹, Marina Kirkitadze¹

¹Analytical Research & Development,Sanofi Pasteur Limited

Summary

시차 주사 열량은 단백질을 변성시키는 데 필요한 열 전이 온도 (들) 및 전체 열 에너지를 측정한다. 얻어진 결과는 백신 제제에 단백질 항원의 열 안정성을 평가하기 위해 사용된다.

Abstract

시차 주사 열량계 (DSC)는 온도의 함수로서 샘플의 몰 열용량을 측정하는 분석 방법이다. 단백질 시료의 경우에, DSC 프로파일은 열 안정성에 대한 정보를 제공하고, 어느 정도의 구조적 형태를 평가하는데 사용될 수있는 구조 "지문"로서 기능한다. (; T _m의 용융 온도) 3 차 구조를 안정화 작용 방해하는 데 필요한 에너지 (엔탈피; ΔH) 단백질 그것은 열 전이 온도를 측정 시차 주사 열량계를 사용하여 수행된다. 비교는 제제뿐만 아니라 생산 로트 사이에, 그리고 파생 된 값의 차이는 열 안정성 및 구조 형태의 차이를 나타냅니다. 안정성 연구 산업 설정 DSC의 사용을 나타낸뿐만 아니라 주요 제조 공정을 모니터링 데이터는 본 프로 효과의 증거로서 제공된다로토콜. 단백질 입체 형태의 열적 안정성을 평가하기위한 다른 방법과 비교하여, DSC는 비용 효율적이고 몇몇 샘플 준비 단계가 필요하고, 또한 단백질을 전개 처리의 완료 열역학적 프로파일을 제공한다.

Introduction

시차 주사 열량계 (DSC)를 직접 조정, 온도 변화 ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ^{^8,} ⁹ 중 참조하는 샘플에 대하여 일어나고 열에너지 흡수에서의 차이를 측정하는 실험 방법 ^{^{^10,}} ^{^11,} ^12. 시차 주사 열량계로 수행, ^상기 방법은 시료 셀과 동일하게 ² 시간 ^이상 ¹³ 두 셀의 온도가 증가하면서 동시에 레퍼런스 셀에 열 에너지를 도입하는 것을 포함한다14. 인해 샘플과 레퍼런스의 조성의 차이에 에너지 상이한 양 세포 ^⁽²⁾ ^{^{^(12, 13)의}} 온도를 높이기 위해 필요하다. 따라서, 셀 사이의 온도 차이를 보상하기 위해 필요한 에너지의 과잉 량을 측정하고, 직접 시료 ^{^{^1,3-}} 특정 열역학적 성질 상관 관계.

1960 년 MJ 오닐과 엘머 E. 왓슨 고체 물질 ^{^2,} ^{^3,} ^4의 열 유량을 측정하는 제 1 차동 주사 열량계를 개발했다. 병행, PL Privalov 및 물리학 연구소의 DR Monaseldze EL 조지아 공화국 (구 소련) fo를 사용할 수있는 고유 한 차동 단열 열량계를 생성연구 생화학 적 연구 ^{^{^(5, 6).}} 그 후, 조지아의 물리학 연구소, 공화국 Andronikashvili의 팀은 이러한 DSC ^{^7,} ^{^8,} ^9를 사용하여 섬유 및 구상 단백질, DNA 및 RNA 등 생체 분자의 열 용량을 보도했다. Sturtevant ^{^10,} ^{^11,} ^12, ¹³ Brandts 및 Privalov ^{^14,} ^{^15,} ¹⁶ 이끄는 몇몇 팀 단백질 전개의 열역학적 세부 사항을 조사하는 이론 및 DSC의 실용적인 애플리케이션의 개발에 초점을 맞추었다. 이러한 파지, 엽록체, 인지질 액정, 고기의 단백질과 같은 큰 초분자 구조를 공부 DSC의 값은 ^{17을보고되었다} </ SUP> ^{^{^18,}} ^{^19,} ^20.

DSC는 이제 생체 분자의 열 안정성의 평가를 위해, 특히 단백질 ^{^1,} ^{^21,} ²² 제약 연구 개발에 일반화되었다. 이 실험 ^{^23,} ^24을 수행하는데 사용되는 장비의 감도 및 자동화 측면에서 진보에 주로 기인한다. 여기서, DSC 실험 온도의 함수로서, 즉 몰 열용량의 최종 결과가 다음과 같은 열역학 매개 변수를 추정하는 데 사용된다 (열용량 (ΔCp), 엔탈피 (ΔH) 엔트로피의 변화 (ΔS) 아래의 수학 식을 이용하여, 깁스의 자유 에너지 (ΔG))

eq1.jpg "/> (1)

(2)

(삼)

(4)

(5)

여기서 CP는 열용량을 측정한다; Q는 시험 재료에 열 흐름이고; T ₀ T는 각각 ^{^22,} ^25의 전환의 초기 및 최종 온도이다. 이 방정식은 상기 두 개의 상태 천이 열 가역 ²² 전개를 겪을 수 단일 도메인 단백질에 적용되는 것을 주목할 가치가있다. 더 복잡한 단백질 (예를 들어, 비 – 두 상태의 단백질, 올리고머) 분석 HFriere 등의 알에 의해보고 된 들이죠. ^(26); 존슨 등. ^(27); 및 Kasimova 등의 알. ^28.

단백질이 두 상태 전이를 겪는 또는 열 변성 동안 중간체를 형성 여부를 확인하기 위해 실험적으로 유도 된 엔탈피 (ΔH는, 또한 열량 엔탈피 ΔH _칼 라한다) 또한 (아래의 반트 호프 방정식을 사용하여 유도 엔탈피와 비교된다 반트 호프 엔탈피로 언급; ΔH _VH)

(6)

T의 _m은 전이의 중앙 온도이고, R은 이상 기체 상수 (1.987 CAL 몰 ^-1 K ^-1)이고, Y는 펼침 상태 ^{^(16),} ⁽²⁹⁾ 단백질 집단의 분획이다. 만약ΔH _VH는 ΔH _칼과 같다; 또는 ΔH _VH / ΔH _{칼 1과} 동일하고 단백질은 "전부 아니면 없음"전환 (즉, 두 상태 전이) ^{^16,} ^{^25,} ^29을 겪는다. 그러나 _{VH ΔH가} ΔH _칼 미만인 경우; 또는 _VH ΔH / ΔH _칼 단백질이 아닌 두 개의 상태 전이 ^{^16,} ^{^25,} ^29을 거쳐, 1 미만이다. ΔH _VH / ΔH _칼의 비율은 열역학적의 공동 부 ⁽²⁶⁾ 또는 도메인 용융 단백질 구조의 비율에 상당한다.

ΔG ΔH와 같은 상술 한 열역학적 파라미터는 생물학적 제제를 포함하는 단백질의 열 안정성에 대한 유용한 정보를 제공 할 ^30. 그들은이 프로토콜에 대한보고 값은 그러나 강조,이 책에서 T의 _m와 ΔH에 배치됩니다. T의 _m은 접힌 단백질의 펼쳐진 상태가 평형 인 전이 (즉, ΔG = 0) ^{^(25),} ^(31)의 중간 지점의 온도이다. 열적 안정성이 ³¹ 이상, 단백질의 T의 _m 높은. ΔH (또한 서모이라고도 함) 온도 그래프 비해 열용량의 피크 (들) 아래에있는 영역에 대응하는 DSC 실험 ^¹⁶ ^(25)의 단부에서 발생. 이 단백질을 변성시키고, 단백질 제제의 활성 분획 (F에서 _A)를 추정하는데 사용될 수있는 필요한 에너지 (즉, 샘플의 활성 형태로 단백질의 비율)은 다음의 방정식을 사용하여 :

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(7)

여기서 ΔH는 단백질 시료의 실험적으로 유도 된 엔탈피이고, Q는 잘 특성화 된 단백질 표준 또는 기준 ^(22)에 대해 결정된 엔탈피이다. F _(A)의 추정은 ICH 가이드 ^(32)에 의해 요구되는 응력 조건에서 안정성 시험을 제품의 실시간 모니터링 안정성뿐만 아니라 행하는 중요하다. ΔH의 비교는 단백질 ^(31)의 차 구조 형태의 소형화에 대한 정보를 제공합니다.

이 프로토콜은 산업 환경에서 단백질의 열 안정성을 평가하기위한 방법에 대해 설명하고 광범위 백신 제형에 사용되어왔다. 이것은 재현성 결과 F를 생성하는 자동화 된 시차 주사 열량계를 사용하여 개발되었다300 μg의 / ㎖만큼 낮은 단백질 농도.

Protocol

1. 악기 시동 시차 주사 열량계를 켜고 샘플 비등을 억제하기 위해 셀 내의 압력을 높일뿐만 아니라, 형성은 승온에서 거품을 방지한다. 이는 일반적으로 시스템에 질소를 공급함으로써 달성된다. 셀 (예를 들어, 탄탈, 금, 백금 등)의 구성 재료에 따라, 세포의 손상을 방지하기 위해 제조자의 권장 압력의 질소 가스의 공급 압력을 조정한다. 예를 들어, 세포에 손상을 줄 수 80 PSI 위 절차를 개발하는 데 사용되는기구 45 PSI의 질소 가스의 공급 압력 및 압력을 설정한다. 모든 세정제 저수지가 필요한 볼륨으로 작성되어 있는지 확인합니다. 필요한 청소 에이전트는 씻어 각 샘플 실행 한 후 각각의 셀을 청소 세제와 물을 포함한다. 샘플 수용 실의 온도를 설정적합한 값, 바람직하게는 5 ° C로 실험 전에 샘플의 무결성을 유지한다. 2. 샘플 준비 실험을위한 기준으로 사용되는 버퍼에 대한 샘플을 투석. 대안 적으로, 단백질의 정제 (즉, 컬럼 용출)의 최종 단계에서 수집 한 용출 완충액을 사용할 수있다. 이러한 방법 Kjedahl 33 로우리 방법 (34)에 가장 적합한 단백질 농도 결정 방법을 이용하여 단백질 시료의 농도를 결정한다. 결과의 객관적인 비교를 위해, 동일한 연구에서 일관 동일한 방법을 사용한다. 필요한 농도 범위는 기기의 모델에 따라 다를 수 있습니다. 1 ㎎ / ㎖ -이 프로토콜에 사용되는 악기를 들어, 바람직한 작동 범위는 0.5입니다. 진공의 샘플 및 참조 버퍼는 볼륨 inaccur가 발생할 수 있습니다 미세 기포를 제거하는 탈기ACY. 이 단계는 새로운 열량계의 모델 건너 뛸 수 있습니다. 층류 biocontainment 캐비닛에 마이크로 피펫과 멸균 팁을 사용하여 기기와 호환 96 웰 플레이트에 쌍으로 샘플과 각각의 버퍼를로드합니다. 버퍼 버퍼 각각 물 스캔 물 버퍼 우물의 첫 두 쌍의 마지막 두 쌍을 입력합니다. 버퍼 버퍼 검사 측정 (계측 오류, 즉 평가) 샘플뿐만 아니라 기준을 설정하기 전에 기기의 적합성을 확인; 물 스캔이 실행되는 동안 세포를 청소합니다. 밀봉 막과 함께 96 웰 플레이트를 커버하고, 웰 적절히 시료의 오염을 방지하기 위해 바이오 캐비닛에서 접시를 취하기 전에 밀폐되도록. 올바른 방향의 샘플 수용 실에 접시를 놓습니다. 3. 실험 매개 변수 설정 참고 : 나는에 따라nstrumentation, 샘플을 수동으로 주사기를 사용하거나 자동 오토 샘플러를 사용하여 세포 내로 로딩 될 수있다. 이 경우 (즉, 산업 설정)에서, 자동 시료 주입기는 시간을 절약하는 데 사용됩니다. 인수 소프트웨어를 사용하여 판은 2.4 절에 따라로드 된 순서대로 샘플 정보를 입력합니다. 가능한 경우 그렇지 않은 경우, 이전 데이터 분석 (4.2)에 대한 분석 소프트웨어에 농도 값을 입력 농도를 입력합니다. 세포에 남아있는 어떤 세제 잔여 물이 없도록하기 위해 여러 물 헹굼 단계에서 준수해야 모든 샘플 검사, 전에 세제로 세포의 청소를 보장하는 옵션을 선택합니다. 20 ° C로 실험의 시작 온도를 설정하지만,이 샘플의 사전 지식에 따라 달라질 수 있습니다. 낮은 시작 온도가 미지 시료에 적용 할 수 있지만 알려진 단백질, 소정의 개시 온도가 사용될 수있다. 최종 온도를 설정실험 예 : 100 ° C. 최종 온도는 시료의 사전 지식에 따라 달라질 수 있습니다. 전형적인 스캔 속도 인 실험의 스캔 속도, 즉 60 ° C / 시간을 설정한다. 그러나, 스캔 속도는 예를 들어, 샘플의 사전 지식에 따라 90 ° C / H, 또는 120 ° C / H 다를 수 있습니다. 전개의 역학을 평가하기 위해 다른 스캔 속도에서 미지 시료를 검사하는 것이 좋습니다. 다시 검사 샘플을 전개 열의 가역성을 조사합니다. 제 2 주사에서 얻은 엔탈피 제 스캔 엔탈피 값의 적어도 80 % 인 경우 단백질 펼쳐지는 가역 여겨진다. 열량계의 세포의 무결성을 유지하기 위해 10 ° C에 대한 사후 실험 온도를 설정합니다. 실험 설정 매개 변수 실험을 실행하기 전에 올바른지 확인합니다. 모든 장소에서의 경우, 실험을 시작한다. 4. 데이터alysis 실험에서 원시 데이터를 검색하고 분석을 위해 한 번에 하나의 샘플을 선택합니다. 샘플 검사에서 빼기 참조 스캔, 즉 버퍼. 주 : 기준 감산 DSC 기기의 새로운 모델에 의해 자동으로 수행된다. 이 섹션 3.1에 따라 생략 된 경우 샘플 농도 값을 입력합니다. 장착하고 전개하면서 물에 소수성 기의 노출에 의해 야기되는 단백질의 접힘과 펼침 상태의 열 용량의 차이를 고려하여 획득 열상에서 기준선을 뺀다. 선형 또는 차 곡선 피팅은 샘플에 대한 DSC 프로파일의 형상에 따라 적용 할 수있다. 일관성을 위해, 끼움 동일한 유형의 연구, 예를 들어 실시간 안정성 시험 동안 사용되어야한다. 이 단계는 최고 통합 전환 엔탈피를 획득하는 곡선을 처리 할 필요가있다. 비선형에게 최소 자승법을 사용하여 피크 통합을 수행합니다. 제품에 따라지식은이 상태 또는 비 두 상태 모델을 적용 할 수 있습니다. 두 상태 모델은 하나의 공동 열 전환에 사용하고, 또한 제품 정보를 사용할 수있을 때까지 미지의 단백질의 비이 상태 모델을 적용 할 수있다. 해당하는 경우 카이 제곱 값이 일정하게 유지 될 때까지 장비의 소프트웨어의 반복 커브 피팅 기능을 사용하여 피팅 곡선을 조정합니다. 얻어진 결과는 전이 온도 (Tm)이, 열량 엔탈피 (ΔH), 샘플의 반트 호프 엔탈피 (ΔH VH)의 중간 값을 표시합니다.

Representative Results

열량계 실제로 시료 용액에 열 유량의 차이를 측정하고, 35 버퍼 가장 DSC 실험에서 원시 데이터는 온도 그래프 대 열유속로 표현된다. 두 세포 (즉, 샘플 및 참조 세포)의 실험 기간 동안 동일한 솔루션을 포함하는 경우 따라서, 검사에서 원시 데이터없이 관찰 봉우리와 평면 줄 수 있어야합니다. 관찰 된 모든 피크는 왜 샘플링하기 전에 분석은 적절한 시스템 적합성 시험이다 버퍼 검사를 실행 계측 오류 (예 : 손상되거나 오염 된 세포)에 기인 할 수있다. 도 1은 열량계 분석을 샘플링하기 전에 양호한 작동 상태임을 나타내는 전형적인 버퍼 스캔의 결과를 나타낸다. 도 2는 DSC 실험을위한 미가공 데이터는 DIFF상에서 수행 도시이 단백질 시료의 erent 많이. 앞에서 암시 된 바와 같이, 관측 된 피크 샘플 및 각 버퍼의 열유속의 차이이다. 시료 농도의 차이에 의해 기록 열량계 열용량의 변동을 일으킬 수있다 그러나, 이러한 변화는 절차의 4.2 절에 따라 시료 분석 중에 정규화. 높은 농도는 낮은 농도에서의 전환에 기여하지 않는 추가 열역학적 도메인을 표시 할 수 있습니다. 또한, 각 전이 단백질 36 개 이상의 구조적 도메인을 포함 할 수있는 열역학적 도메인을 나타낸다. 이 경우, 상기 단백질은 1 협동 용융과 같은 3 개의 구조 영역을 가진다. 도 3은베이스 라인 및 감산 반복 곡선 인터넷 후, 즉도 2에 제시된 단백질 1 및 2에 대한 원시 데이터의 분석에서 생성 된 결과를 도시tting. 얻어진 온도 자기 기 (thermograms)은 스캐닝 속도에 대해 규격화 된 농도 (자동으로 미리 설정된 분석 소프트웨어 알고리즘에 의해 수행); 따라서, 온도에 비해 비교 그래프 열용량 실험 결과를 제시. 분석 소프트웨어는 전개 단백질 협동성에 따라 상기 주어진 방정식의 변형을 사용하여 다른 열역학적 파라미터를 유도하기 위해, 예컨대 T의 m 및 ΔCp 같은 온도 그래프 비해 열용량의 데이터를 사용한다. 설정 미지 시료를 테스트 할 때 적절한 온도 범위는 매우 중요하다. 그림 4에 도시 된 바와 같이, 그렇지 않으면 불완전한 온도 자기 기 (thermograms)가 발생할 수 있습니다. 이러한 프로파일에서 T의 m이 도출 될 수 있지만, ΔH는 정확하게 결정될 수 없다. 따라서, 시료가 완전히 열 전이를 캡처 큰 온도 범위 재시험되어야한다. 일부 단백질은 다시adily 형태는 증가 후 전이 열용량 얻어진 완전 변성 후 집계 :도 2b에 도시 된 바와 같이이 종종 불완전 서모 그램으로 나타난다. 그러나, 높은 최종 온도와 재검사하는 것은 거기에 열상의 영역에서의 구조적 전환의 발생 또는이 단백질 응집체의 단지 열 흡수 효과 여부를 확인 할 수 있습니다. 열 안정성은 업계 37 단백질과 단백질 기반 제품의 가장 중요한 물리적 특성 중 하나입니다. 제약에서, 제형 버퍼와 습도 및 온도와 같은 환경 적 요인 등 다양한 조건 하에서 생물학적 제제의 안정성을 결정하는 데 사용된다. 또한 생산 로트 사이의 구조적 일관성을 유지하기 위해 주요 제조 단계 (예를 들어, 정화 및 해독)를 모니터링하는 데 사용됩니다. <strong >도 5 및도 6은 안정성 두 가지 단백질의 입체 구조에 각각 화학 해독 및 저장 조건의 영향을 조사하는 DSC의 사용을 예시한다. Tm은와 ΔH의 유의 한 차이는 각각 구조적 변화와 단백질 분해를 나타냅니다. 또한,도 6의 세번째 전환 손실이 상기 (시료가 멀티 앵글 빛 산란 (SEC-MALS)를 크기 – 배제 크로마토 그래피를 이용하여 분석 한 결과, 분자량의 저하에 의해 확인 된 도메인의 열화를 도시 데이터) 미도. 그림 1 : 버퍼를 검색합니다. 더 관찰 봉우리와 각 스캔의 기울기의 유사성은 장비가 잘 작동 상태이고 재현 가능한 결과를 생성 함을 나타냅니다.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2 : DSC 실험에서 수집 된 원시 데이터입니다. 이 그래프는 (즉, 이전의 기본 공제와 커브 피팅에) 실험을 실행 한 후 획득 한 unanalyzed (원시) 데이터의 좋은 표현이다. 각 라인은 생산 로트를 나타냅니다. 단백질 2 서모 후행 전이 영역에서 100 ℃ 이상의 열 용량의 증가의 결과로, 가열에 의해 더욱 용이하게 응집하는 경향이있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <br/> 그림 3 : DSC 데이터 분석. 이 그래프는 (즉, 기본 공제와 커브 피팅 후) 분석 DSC 데이터의 좋은 표현이다. 빨간색 선은 열상에 가장 적합한와 곡선을 나타내고 파란색 선은 기본 공제 후 열상을 나타냅니다. (A) 1 단백질 샘플 # 12에 대한 T 및 m의 ΔH는 80.16 ° C 각각 1.69 × 106 CAL / 몰이다. (B) 단백질 1 샘플 # 13에 대한 T의 m와 ΔH는 80.15 ° C 각각 1.71 × 10 6 칼 / 몰이다. (C) 단백질이 샘플 # 21에 대한 T의 m와 ΔH는 75.01 ° C 각각 4.08 × 10 6 칼 / 몰이다. (D) 단백질이 샘플 # 22에 대한 T의 m와 ΔH는 75.67 ° C 각각 4.22 × 10 6 칼 / 몰이다. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. 그림 4 : 불완전한 열상. 원시 데이터는 부적절한 온도 범위에서 분석 단백질 1 수집합니다. 실험의 최종 온도는 120 ℃로 설정 한도 2a에 대한 실험과 비교하여, 단백질의 전체 천이 프로파일을 수용하지 않은 90 ° C로 설정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5 : 데이터 단백질 1 (A) 단백질 1 차 구조에 화학 물질의 해독의 효과를보기 분석 헥타르의 기본 형태와의 독소2.57 × 10 5 CAL / 몰에서의 T의 56.84 ° C에서 m와 ΔH는이야. (B) 단백질 1 (즉, 톡소이드)의 해독 형태는 각각 T의 m와 81.01 ° C의 ΔH 값과 1.89 × 10 6 칼 / 몰을 보유하고 있습니다. 따라서, 해독 단계는 해독 된 형태보다 안정성 (더 높은 T를 m)를 부여하는 단백질 (1)의 구조적인 형태로 변화의 형태를 도입한다는 결론을 내릴 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6 :이 그래프는 저장 온도의 효과를 보여주는 데이터 단백질 (3)의 형태에 저장 조건의 효과를보기 분석 (2-8 ° C) 안정성과 프로의 차 구조에3 30 주 이상에서 단백질. T 개의 m 및 제 8 (A)에서 (3) 단백질 및 스토리지의 38 번째 주 (B)에 대한 ΔH 값은 다음 표 1과 같다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 견본 TM 1 (° C) ΔH 1 (CAL / 몰) TM 2 (° C) ΔH 2 (CAL / 몰) TM 3 (° C) ΔH 3 (CAL / 몰) 단백질 3 8 주 동안 2-8 ℃에서 보관 61.91 1.71 × 10 (5) 75.54 2.17 × 10 (5) 90.29 4.17 × 10 (5) <tD> 단백질 3 38 주 동안 2-8 ° C에 저장 61.87 1.66 × 10 (5) 75.18 1.46 × 10 (5) 90.22 5.76 × 10 (5) 표 1 : 2에서 스토리지의 8 번째와 38 번째 주에 단백질 3 Tm은과 ΔH 값 – 8 ° C를. 두 시점에서 T의 m 값은 유사하지만, ΔH의 값의 차이는 단백질의 3 차 구조가 특정의 보존 조건 30주 위에 저하되었음을 나타낸다.

Discussion

이 절차가 성공적으로 안정성 및 제품의 비교 연구 ^(21)을 포함하는 다양한 특성을 테스트 패키지에 포함하고있다. 실시간 안정성 시험에서, DSC는 저장 수명을 결정하기 위해 T _{m의 모니터링뿐만} 아니라, 시간에 따른 생물의 _F에게를 추정하는데 사용된다. 제품의 비교에 관해서, 프로세스 및 기능 변화의 영향뿐만 아니라, 제조 로트의 구조적 형태의 주요 제조 공정의 효과를 평가하기 위해 사용된다. 이는 일반적으로 이상적인 제품으로 지정되어있는 참조 제품 생산 로트의 ΔH의 직접 비교를 수반한다. 또한, DSC 제품 제형 연구 ³⁷ 유용한 분석 도구임이 입증되었다. 상이한 완충제와 상이한 농도에서의 단백질의 _{T는 m으로} 가장 안정 proffers 제제를 결정하는데 사용될 수있다단백질.

이 방법 및 그 결과의 객관성 안정성을 위해서는, 동일한 연구 (예를 들면, 백신 제제 연구) 내에서 실행하는 런타임 일관된 테스트 파라미터를 유지하는 것이 중요하다. 그러나, 절차는 다양한 단백질의 물리적 특성의 차이를 수용하도록 수정 될 수있다. 이루어질 수있는 변형 예는 실험 ^³⁸ ^(39)의 주사 속도를 변경한다. 빠른 주사 속도로 조사 하였다 가열시 형성 응집하는 경향이 있었다 단백질 (예를 들면, 120 ° C / H)는 칼로리의 모세 혈관 막힘뿐만 아니라 열 전이 프로필 응집체의 기여를하지 않도록한다. 이 비율을 주사하는 단계 DSC 실험 ^38의 결과에 영향을 미칠 수 있음을 주목할 필요가있다. 열 전이 피크의 확대 일부 Pro의 스캐닝 속도가 증가함에 따라 관찰되었다teins; 그러나, T의 _{m 상당히} 일정 ³⁸ 남았다. 또한, 샘플 준비를위한 투석 및 가스 제거 단계는 정확한 결과를 ^{31 일에} 매우 중요하다. 투석 샘플 및 버퍼의 조성물의 유일한 차이는 단백질을 보장; 따라서, 상기 시료에 의해 흡수 된 모든 과량의 열은 단백질의 열용량에 기인 할 수있다. 열역학 매개 변수의 추정이 펼쳐지는 이벤트가 일정한 부피와 압력 ^(31)에서 발생한다고 가정으로 탈은 정확한 볼륨 분석을 보장합니다. 가정의 정압 부 절차 섹션 1.1에 따라 시스템의 질소 가압에 의해 차지된다.

이러한 원 편광 이색 (CD) 및 형광 분광기 등의 단백질 입체의 안정성을 결정하는 다른 방법과 비교하여, DSC가 COM에서 장점을 제공한다비용과 시간 절감을 포함한 상업용 설정. CD 형광 분광기 ⁶ 장비와 측정과 비교하여 우선, 시차 주사 열량계의 단열 설계 온도보다 정밀도 열 안정성의 측정을 허용한다. 둘째, CD와 달리, DSC 데이터의 정확도는 단백질 ^³⁹ ^(40)의 나선 성에 의존하지 않는다; 그러나, CD는 상기 DSC ^(41)에 무료 것 이차 구조의 전개에 대한 추가 정보를 제공합니다. 또한, DSC 시스템의 가압 샘플 비등없이 넓은 온도 범위에서 시험 할 수; 따라서, 단백질의 넓은 범위는 DSC에 의해 시험 될 수있다.

DSC는 생물학적 제제의 열 안정성을 결정하기 위해 비교적 빠르고 간단한 방법이지만, 한계가없는 것은 아니다. 우선,베이스광고 감산 단계는 원시 데이터 분석으로 인간 불일치 형태를 도입; 따라서, 결과에서의 변화는 상이한 사용자들 사이에서 관측 될 수있다. 둘째, 시차 주사 열량계 대량 생산 규모에서 달성하기 어려울 수있는 최소한의 농도 한계가있다. 비가역 열 변성 셋째, ΔH 절대 아니다; 이는 유사한 시나리오에서 유래 ΔG (단백질 안정성의 지표가) 오해의 소지가 될 수 있다는 것을 의미한다. 또한,이 방법은 정제 된 샘플에 가장 적합합니다. 상호 작용이없는 경우는 조사중인 단백질 또는 새로운 열 천이의 모양과의 상호 작용이있는 경우 불순물의 존재는 T에서 _m의 변화를 일으킬 수도 있고. 어떠한 경우에서도 온도 자기 기 (thermograms)에 추가 기능이 잘못 따라서 결과의 해석에 영향을 샘플에 기인 할 수있다. 이러한 한계에도 불구하고, DSC는 일에 대한 자세한 열역학 정보를 제공 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 유지제대로 ⁽⁴²⁾ 구현 경우 프로세스를 전개 전자 단백질.

결론적으로, DSC는 백신 제품 및 중간체에 대한 구조적인 판독 도구로 상당한 이점을 제공한다. 동일한 제품을 많이 배열 수집 개의 파라미터 T의 _m과 ΔH는 프로세스 변경, 제형 및 삼차 구조에 저장 조건과 단백질의 안정성에 미치는 영향을 조사하는데 사용될 수있는 경험적 기준이 될 수 있으며 바이러스 항원 ^{^21,} ^43.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 자신의 토론에 대한 시차 주사 열량계, Sasmit Deshmukh 및 웹스터 Magcalas의 설치 및 교육에서 자신의 역할에 대해 (이전 GE 헬스 케어와) 조셉 만치니, 파블 Czudec, 토마스 케이지 (Malvern 인스 트루먼 제한)에 매우 감사하다.

Materials

Differential Scanning Calorimeter	Malvern Instruments Ltd	28428948 (Via GE Healthcare)	Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.
Contrad 100	Decon Laboratories Inc	1504	Dilute with water to 20% before use
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate	Canadian Life Science	ML072100	Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used
MicroCal ThermoVac	Malvern Instruments Ltd	N/Ap	provided with the Cap VP DSC
Biosafety cabinet	Labconco	Logic+ – A2	biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation
Slide-A-Lyzer dialysis cassette	Thermo Scientific	66810 or 66380	to equilibrate the sample and buffer

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Cite This Article

Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen. J. Vis. Exp. (121), e55262, doi:10.3791/55262 (2017).

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