Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Изучение того, как макромолекулы складываются и взаимодействуют друг с другом, является ключом к пониманию регуляции генов в клетке. Несмотря на то, что в последнее десятилетие были предприняты значительные усилия для понимания того, как ДНК и белки способствуют регуляции генов, относительно меньше посттранскрипционной регуляции экспрессии генов известно относительно меньше. РНК несет информацию как в своей линейной последовательности, так и в ее вторичной и третичной структуре ¹ . Его способность основывать пар с собой и с другими имеет важное значение для его функции in vivo . Недавние успехи в зондировании вторичной структуры с высокой пропускной способностью РНК дали ценную информацию о расположении двойных и одноцепочечных областей в транскриптоме ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howeВерная информация о партнерах по парному взаимодействию все еще в значительной степени отсутствует. Чтобы определить, какая последовательность РНК взаимодействует с другой областью РНК в транскриптоме, нам нужна глобальная парная информация.

Традиционно картографирование парных взаимодействий РНК глобальным, беспристрастным образом является серьезной проблемой. В то время как предыдущие подходы, такие как CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ и RAP ¹¹ , используются для идентификации взаимодействий РНК широкомасштабным образом, эти методы обычно отображают спаривание оснований РНК для подмножества РНК, которые либо взаимодействуют с конкретным видом белка, либо РНК. Недавние разработки в изучении взаимодействий в глобальной РНК включают метод RPL ¹² , который не стабилизирует взаимодействия РНК in vivo и, следовательно, может захватывать только часть взаимодействий in vivo . Чтобы преодолеть эти трудности, мы и другие разработали универсальные, беспристрастные стратегии для маР-РНК взаимодействует in vivo с использованием модифицированных вариантов сшивающего агента psoralen ^{13 , 14 , 15} . В этом протоколе мы описываем детали для выполнения S- согласования P сoralen сшитого, Ligated и S выбранных H ybrids (SPLASH), который использует биотинилированный псорален для сшивания базовых спаривающих РНК in vivo с последующим лигированием близости и высокой пропускной последовательностью, чтобы Идентифицировать партнеров по связыванию с основанием РНК по всему геному ( Рисунок 1 ) ¹⁵ .

В этой рукописи мы описываем шаги для выполнения SPLASH с использованием культивируемых клеток-приверженцев, в данном случае клеток HeLa. Тот же протокол может быть легко адаптирован к суспензионным клеткам млекопитающих и дрожжевым и бактериальным клеткам. Вкратце, клетки HeLa обрабатывают биотинилированным псораленом и облучают при 365 нм для сшивания взаимодействующих пар оснований РНК in vivo, РНК затем экстрагируют из клеток, фрагментируют и обогащают для сшивания областей, используя стрептавидиновые гранулы. Взаимодействующие фрагменты РНК затем лигируют вместе с использованием лигирования по близости и превращают в библиотеку кДНК для глубокого секвенирования. После секвенирования химерные РНК отображаются на транскриптом / геном, чтобы идентифицировать области взаимодействия РНК, которые спарены друг с другом. Мы успешно использовали SPLASH для идентификации тысяч взаимодействий РНК in vivo у дрожжей и различных человеческих клеток, включая внутримолекулярное и межмолекулярное спаривание РНК в различных классах РНК, таких как snoRNAs, lncRNAs и мРНК, чтобы заглянуть в структурную организацию и образцы взаимодействия РНК в клетке.