Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Estudar como as macromoléculas se dobram e interagem entre si é a chave para a compreensão da regulação genética na célula. Embora muitos esforços tenham sido focados na década passada na compreensão de como o DNA e as proteínas contribuem para a regulação genética, relativamente menos se sabe sobre a regulação pós-transcricional da expressão gênica. O ARN contém informação tanto na sua sequência linear como na sua estrutura secundária e terciária ¹ . Sua capacidade de basear o par com si e com os outros é importante para a sua função in vivo . Os avanços recentes na sondagem de estrutura secundária de RNA de alto rendimento proporcionaram informações valiosas sobre as localizações de regiões duplas e de cadeia simples no transcriptoma ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howeVer informações sobre o emparelhamento interação parceiros ainda está em grande parte ausente. Para determinar qual a sequ�cia de ARN que interage com outra regi� de ARN no transcriptoma, necessitamos de informa�o global de pares.

Mapear par-sábio RNA interações em um global, imparcial forma tem sido tradicionalmente um grande desafio. Embora as abordagens anteriores, tais como CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ e RAP ¹¹ , sejam usadas para identificar as interações de RNA em uma maneira de grande escala, essas técnicas tipicamente mapeiam o par de bases de RNA para um subconjunto de RNAs que interagem com uma determinada proteína ou espécies de RNA. Os desenvolvimentos recentes no estudo de interacções de ARN globais incluem o método RPL ¹² , que não estabiliza as interacções de ARN in vivo e, portanto, só pode capturar um subconjunto de interacções in vivo . Para superar esses desafios, nós e outros desenvolvemos estratégias genéticas, semP ARN interacional in vivo , utilizando versões modificadas do reticulador psoraleno ^{13 , 14 , 15} . Neste protocolo, descrevemos os pormenores para realizar a equalização de S de Hélidos H reticulados, S igated e S elegidos por P soralen (SPLASH), que utiliza psoraleno biotinilado para reticular ARNs de emparelhamento de bases in vivo , seguido por ligação de proximidade e sequenciação de alto rendimento a Identificar parceiros de ARN-base de ligação genoma-wide ( Figura 1 ] ¹⁵ .

Neste manuscrito, descrevemos as etapas para realizar SPLASH usando células aderentes cultivadas, neste caso células HeLa. O mesmo protocolo pode ser facilmente adaptado a células de mamífero de suspensão e a células de levedura e bactérias. Resumidamente, as células HeLa são tratadas com psoraleno biotinilado e irradiadas a 365 nm para interligar os pares de bases de ARN em interacção in vivo. Os RNAs são então extraídos das células, fragmentados e enriquecidos para regiões de reticulação usando esferas de estreptavidina. Os fragmentos de ARN que interagem são então ligados em conjunto utilizando ligadura de proximidade e transformados numa biblioteca de cDNA para sequenciação profunda. Após sequenciação, os ARN quiméricos são mapeados no transcriptoma / genoma para identificar as regiões que interagem com o ARN que estão emparelhadas entre si. Utilizamos com sucesso SPLASH para identificar milhares de interações de RNA in vivo em leveduras e diferentes células humanas, incluindo emparelhamento de ARN intramolecular e intermolecular em diversas classes de RNAs, como snoRNAs, lncRNAs e mRNAs, vislumbrando os padrões de organização estrutural e interação De RNAs na célula.