Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Studiare come macromolecole si piegano e interagiscono tra loro è la chiave per comprendere la regolazione del gene nella cellula. Mentre molti sforzi sono stati focalizzati nell'ultimo decennio per comprendere come il DNA e le proteine ​​contribuiscono alla regolazione del gene, è relativamente meno noto circa la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica. L'RNA trasporta informazioni sia nella sequenza lineare che nella struttura secondaria e terziaria ¹ . La sua capacità di fondare la coppia con se stessa e con gli altri è importante per la sua funzione in vivo . I progressi recenti nel sondaggio della struttura secondaria RNA a elevata produttività hanno fornito preziosi approfondimenti sulle posizioni delle regioni a doppia e singola banda nel transcriptoma ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howeVer le informazioni sui partner di interazione di coppia sono ancora in gran parte mancanti. Per determinare quale sequenza RNA interagisce con un'altra regione RNA nel trascrittoma, abbiamo bisogno di informazioni globali a livello di coppia.

La mappatura delle interazioni RNA in coppia in maniera globale e imparziale è stata tradizionalmente una grande sfida. Mentre gli approcci precedenti, come CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ e RAP ¹¹ , vengono utilizzati per identificare le interazioni RNA in modo scalare, queste tecniche tipicamente mappano l'accoppiamento base di RNA per un sottoinsieme di RNA che interagiscono con una particolare specie di proteine ​​o RNA. Gli sviluppi recenti nello studio delle interazioni globali di RNA includono il metodo RPL ¹² , che non stabilizza le interazioni RNA in vivo e quindi può solo catturare un sottoinsieme di interazioni in vivo . Per superare queste sfide, noi e gli altri abbiamo sviluppato strategie prive di genoma e maestoseP interazioni di RNA in vivo , utilizzando versioni modificate del psoralen ^{13 , 14 , 15} del reticolatore. In questo protocollo, descriviamo i dettagli per eseguire l'equilibrio di S di P soralen incrociato, L igato e S eligibriti (SPLASH), che utilizza il psoralene biotinilato in RNA in accoppiamento a base di collegamento in vivo in seguito alla legatura di prossimità e ad alta sequenza di throughput a Individuare i partner RNA base-pairing in tutto il genoma ( Figura 1 ) ¹⁵ .

In questo manoscritto descriviamo i passaggi per eseguire SPLASH utilizzando cellule aderenti colte, in questo caso le cellule HeLa. Lo stesso protocollo può essere facilmente adattato alle cellule di mammiferi di sospensione e alle cellule di lievito e batteri. In breve, le cellule HeLa vengono trattate con psoralene biotinilato e irradiati a 365 nm per incrociare in coppia le coppie di RNA interattive in vivo. I RNA vengono quindi estratti dalle cellule, frammentati e arricchiti per le regioni di reticolazione usando perline di streptavidina. I frammenti RNA interattivi vengono quindi legati insieme usando la legatura di prossimità e fatti in una libreria di cDNA per la sequenza profonda. Al sequenziamento, gli RNA chimerici vengono mappati sul transcriptome / genoma per identificare le regioni interagenti RNA che sono accoppiate tra loro. Abbiamo utilizzato con successo SPLASH per identificare migliaia di interazioni RNA in vivo in lieviti e diverse cellule umane, tra cui l'accoppiamento base di RNA intramolecolare e intermolecolare in diverse classi di RNA, come snoRNA, lncRNA e mRNA, per intravedere nell'organizzazione strutturale e nei modelli di interazione Di RNA nella cella.