Ici, nous détaillons la méthode de l'équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), ce qui permet une cartographie génomique des interactions intra-moléculaires et intermoleculaires d'ARN-ARN in vivo . SPLASH peut être appliqué pour étudier les interactions de l'ARN des organismes, y compris la levure, les bactéries et les humains.
Savoir comment les ARN interagissent avec eux-mêmes et avec d'autres sont essentiels à la compréhension de la régulation des gènes basée sur l'ARN dans la cellule. Bien que des exemples d'interactions ARN-ARN telles que les interactions entre ARNm et ARNm aient montré qu'ils régulent l'expression des gènes, la mesure dans laquelle les interactions ARN se produisent dans la cellule est encore inconnue. Les méthodes antérieures pour étudier les interactions de l'ARN ont principalement porté sur des sous-groupes d'ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d'ARN. Ici, nous détaillons une méthode appelée S équation de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH) qui permettent une capture intégrale des interactions de l'ARN dans le génome in vivo de manière impartiale. SPLASH utilise une réticulation in vivo , une ligature de proximité et un séquençage à haut débit pour identifier globalement les partenaires intramoléculaires et intermoleculaires de base d'ARN. SPLASH peut être appliqué à différents organismes, y compris des bactéries, des levures et des cellules humaines, ainsi qu'uneDes conditions cellulaires diverses pour faciliter la compréhension de la dynamique de l'organisation de l'ARN dans divers contextes cellulaires. L'ensemble du protocole SPLASH expérimental prend environ 5 jours pour être complété et le flux de travail informatique prend environ 7 jours pour être complété.
Étudier comment les macromolécules se plient et interagissent entre elles est la clé pour comprendre la régulation des gènes dans la cellule. Bien que de nombreux efforts aient été concentrés au cours de la dernière décennie pour comprendre comment l'ADN et les protéines contribuent à la régulation des gènes, on connaît relativement moins de la régulation post-transcriptionnelle de l'expression des gènes. L'ARN porte des informations à la fois dans sa séquence linéaire et dans sa structure secondaire et tertiaire 1 . Sa capacité à baser la paire avec elle-même et avec d'autres est importante pour sa fonction in vivo . Les progrès récents dans la sondage de la structure secondaire de l'ARN à haut débit ont fourni des informations précieuses sur les emplacements des régions à double et simple brin dans le transcriptome 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , HoweLes informations sur les partenaires d'interaction d'appariement manquent encore. Pour déterminer quelle séquence d'ARN interagit avec une autre région d'ARN dans le transcriptome, nous avons besoin d'informations globales en paire.
La cartographie par paire d'interactions ARN d'une manière globale et impartiale a traditionnellement été un défi majeur. Alors que les approches antérieures, telles que CLASH 9 , hiCLIP 10 et RAP 11 , sont utilisées pour identifier les interactions de l'ARN à grande échelle, ces techniques classent généralement l'association de base d'ARN pour un sous-ensemble d'ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d'ARN. Les développements récents dans l'étude des interactions globales de l'ARN comprennent la méthode RPL 12 , qui ne stabilise pas les interactions de l'ARN in vivo et ne peut donc capturer qu'un sous-ensemble d'interactions in vivo . Pour surmonter ces défis, nous et d'autres avons développé des stratégies à l'échelle du génome et impartiales à maP ARNA interagère in vivo , en utilisant des versions modifiées du réticulant psoralen 13 , 14 , 15 . Dans ce protocole, nous décrivons les détails pour effectuer l'équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), qui utilise du psoralène biotinylé pour reticuler l'association des ARN in vivo , suivie d'une ligature de proximité et d'un séquençage à haut débit pour Identifiez les partenaires de base de l'ARN au niveau du génome ( Figure 1 ) 15 .
Dans ce manuscrit, nous décrivons les étapes pour effectuer SPLASH à l'aide de cellules adhérentes cultivées, dans ce cas, des cellules HeLa. Le même protocole peut être facilement adapté aux cellules de mammifères en suspension et aux cellules de levure et de bactéries. En bref, les cellules HeLa sont traitées avec du psoralène biotinylé et irradiées à 365 nm pour paires de bases d'ARN interactives par liaison croisée in vivo. Les ARN sont ensuite extraits des cellules, fragmentés et enrichis pour les régions de réticulation en utilisant des billes de streptavidine. Les fragments d'ARN interagissant sont ensuite ligaturés ensemble en utilisant une ligature de proximité et transformés en une banque d'ADNc pour un séquençage profond. Lors du séquençage, les ARN chimériques sont mappés sur le transcriptome / génome pour identifier les régions qui interagissent avec l'ARN qui sont couplées l'une à l'autre. Nous avons utilisé SPLASH avec succès pour identifier des milliers d'interactions d'ARN in vivo dans la levure et différentes cellules humaines, y compris le couplage intramoléculaire et intermoleculaire de base d'ARN dans diverses classes d'ARN, tels que snoRNAs, lncRNAs et mRNAs, pour apercevoir l'organisation structurelle et les modèles d'interaction Des ARN dans la cellule.
Ici, nous décrivons en détail le flux de travail expérimental et informatique pour SPLASH, une méthode qui nous permet d'identifier les interactions ARN en paire d'une manière généreuse. Nous avons utilisé avec succès SPLASH dans les cultures bactériennes, de levure et humaines et prévoyons que la stratégie peut être largement appliquée à divers organismes sous différents états cellulaires. L'une des étapes critiques du protocole consiste à commencer par au moins 20 μg d'ARN réticul?…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les membres du laboratoire Wan et du laboratoire Nagarajan pour des discussions informatives. N. Nagarajan est soutenu par un financement de A * STAR. Y.Wan est soutenu par le financement de A * STAR et Society in Science-Branco Weiss Fellowship.
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
20 % SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
List of software required | |||
FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
Buffer composition | |||
Elution buffer: | |||
0.3 M sodium acetate | |||
Lysis Buffer: | |||
50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
10 mM EDTA | |||
1% SDS | |||
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
Proteinase K Buffer | |||
100 mM NaCl | |||
10 mM TrisCl pH 7.0 | |||
1 mM EDTA | |||
0.5% SDS | |||
Hybridization Buffer | |||
750 mM NaCl | |||
1% SDS | |||
50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
1 mM EDTA | |||
15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
Always add Superase-in fresh before use | |||
2x SSC Wash Buffer | |||
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
0.5% SDS | |||
2X RNA fragmentation buffer | |||
18mM MgCl2 | |||
450mM KCl | |||
300mM Tris-CL pH 8.3 | |||
2x RNA loading Dye: | |||
95% Formamide | |||
0.02% SDS | |||
0.02% bromophenol blue | |||
0.01% Xylene Cyanol | |||
1mM EDTA | |||
3' RNA adapter sequence | 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC | ||
RT primer sequence | AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |