Summary

Cartographie des interactions ARN-ARN à l'échelle mondiale à l'aide de psoralène biotinylé

Published: May 24, 2017
doi:

Summary

Ici, nous détaillons la méthode de l'équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), ce qui permet une cartographie génomique des interactions intra-moléculaires et intermoleculaires d'ARN-ARN in vivo . SPLASH peut être appliqué pour étudier les interactions de l'ARN des organismes, y compris la levure, les bactéries et les humains.

Abstract

Savoir comment les ARN interagissent avec eux-mêmes et avec d'autres sont essentiels à la compréhension de la régulation des gènes basée sur l'ARN dans la cellule. Bien que des exemples d'interactions ARN-ARN telles que les interactions entre ARNm et ARNm aient montré qu'ils régulent l'expression des gènes, la mesure dans laquelle les interactions ARN se produisent dans la cellule est encore inconnue. Les méthodes antérieures pour étudier les interactions de l'ARN ont principalement porté sur des sous-groupes d'ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d'ARN. Ici, nous détaillons une méthode appelée S équation de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH) qui permettent une capture intégrale des interactions de l'ARN dans le génome in vivo de manière impartiale. SPLASH utilise une réticulation in vivo , une ligature de proximité et un séquençage à haut débit pour identifier globalement les partenaires intramoléculaires et intermoleculaires de base d'ARN. SPLASH peut être appliqué à différents organismes, y compris des bactéries, des levures et des cellules humaines, ainsi qu'uneDes conditions cellulaires diverses pour faciliter la compréhension de la dynamique de l'organisation de l'ARN dans divers contextes cellulaires. L'ensemble du protocole SPLASH expérimental prend environ 5 jours pour être complété et le flux de travail informatique prend environ 7 jours pour être complété.

Introduction

Étudier comment les macromolécules se plient et interagissent entre elles est la clé pour comprendre la régulation des gènes dans la cellule. Bien que de nombreux efforts aient été concentrés au cours de la dernière décennie pour comprendre comment l'ADN et les protéines contribuent à la régulation des gènes, on connaît relativement moins de la régulation post-transcriptionnelle de l'expression des gènes. L'ARN porte des informations à la fois dans sa séquence linéaire et dans sa structure secondaire et tertiaire 1 . Sa capacité à baser la paire avec elle-même et avec d'autres est importante pour sa fonction in vivo . Les progrès récents dans la sondage de la structure secondaire de l'ARN à haut débit ont fourni des informations précieuses sur les emplacements des régions à double et simple brin dans le transcriptome 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , HoweLes informations sur les partenaires d'interaction d'appariement manquent encore. Pour déterminer quelle séquence d'ARN interagit avec une autre région d'ARN dans le transcriptome, nous avons besoin d'informations globales en paire.

La cartographie par paire d'interactions ARN d'une manière globale et impartiale a traditionnellement été un défi majeur. Alors que les approches antérieures, telles que CLASH 9 , hiCLIP 10 et RAP 11 , sont utilisées pour identifier les interactions de l'ARN à grande échelle, ces techniques classent généralement l'association de base d'ARN pour un sous-ensemble d'ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d'ARN. Les développements récents dans l'étude des interactions globales de l'ARN comprennent la méthode RPL 12 , qui ne stabilise pas les interactions de l'ARN in vivo et ne peut donc capturer qu'un sous-ensemble d'interactions in vivo . Pour surmonter ces défis, nous et d'autres avons développé des stratégies à l'échelle du génome et impartiales à maP ARNA interagère in vivo , en utilisant des versions modifiées du réticulant psoralen 13 , 14 , 15 . Dans ce protocole, nous décrivons les détails pour effectuer l'équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), qui utilise du psoralène biotinylé pour reticuler l'association des ARN in vivo , suivie d'une ligature de proximité et d'un séquençage à haut débit pour Identifiez les partenaires de base de l'ARN au niveau du génome ( Figure 1 ) 15 .

Dans ce manuscrit, nous décrivons les étapes pour effectuer SPLASH à l'aide de cellules adhérentes cultivées, dans ce cas, des cellules HeLa. Le même protocole peut être facilement adapté aux cellules de mammifères en suspension et aux cellules de levure et de bactéries. En bref, les cellules HeLa sont traitées avec du psoralène biotinylé et irradiées à 365 nm pour paires de bases d'ARN interactives par liaison croisée in vivo. Les ARN sont ensuite extraits des cellules, fragmentés et enrichis pour les régions de réticulation en utilisant des billes de streptavidine. Les fragments d'ARN interagissant sont ensuite ligaturés ensemble en utilisant une ligature de proximité et transformés en une banque d'ADNc pour un séquençage profond. Lors du séquençage, les ARN chimériques sont mappés sur le transcriptome / génome pour identifier les régions qui interagissent avec l'ARN qui sont couplées l'une à l'autre. Nous avons utilisé SPLASH avec succès pour identifier des milliers d'interactions d'ARN in vivo dans la levure et différentes cellules humaines, y compris le couplage intramoléculaire et intermoleculaire de base d'ARN dans diverses classes d'ARN, tels que snoRNAs, lncRNAs et mRNAs, pour apercevoir l'organisation structurelle et les modèles d'interaction Des ARN dans la cellule.

Protocol

1. Traitement des cellules HeLa avec extraction du psoralène biotinylé et de l'ARN Culture Les cellules HeLa dans le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) complétées par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de streptomycine pénicilline (PS) dans une plaque de 10 cm. Lavez les cellules HeLa deux fois avec 5 mL de 1x PBS. Égoutter l'excès de PBS complètement du plat en plaçant le plat verticalement pendant 1 min. Ajouter 1 ml de PBS contenant 200 uM de psoralène…

Representative Results

La figure 1 représente le schéma du flux de travail SPLASH. Lors de l'addition de psoralène biotinylé en présence de 0,01% de digitonine et de réticulation UV, l'ARN total est extrait des cellules et un point-tache est réalisé pour s'assurer que la réticulation du biotinylé à l'ARN s'est produite efficacement ( figure 2 ). Nous utilisons des oligos biotinylés de 20 bases comme témoins positifs po…

Discussion

Ici, nous décrivons en détail le flux de travail expérimental et informatique pour SPLASH, une méthode qui nous permet d'identifier les interactions ARN en paire d'une manière généreuse. Nous avons utilisé avec succès SPLASH dans les cultures bactériennes, de levure et humaines et prévoyons que la stratégie peut être largement appliquée à divers organismes sous différents états cellulaires. L'une des étapes critiques du protocole consiste à commencer par au moins 20 μg d'ARN réticul?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres du laboratoire Wan et du laboratoire Nagarajan pour des discussions informatives. N. Nagarajan est soutenu par un financement de A * STAR. Y.Wan est soutenu par le financement de A * STAR et Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

Materials

1 Kb Plus DNA Ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10787026 DNA ladder
10 bp DNA ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10821-015 DNA ladder
20 % SDS solution First BASE BUF-2052-1L  
20x SSC First BASE BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution First BASE BUF-1151-1L-pH5.2   Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 Bio-Rad 1610145 TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit Life Technologies Holdings Pte Ltd AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade   Promega V3131  TBE Urea gel component
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Chloroform Merck 1.02445.1000 RNA extraction
Single strand DNA ligase Epicentre CL9025K CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters Sigma-Aldrich CLS8160-96EA Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE Sigma-Aldrich D5628-1G For cell treatment
Dark Reader Transilluminator  Clare Chemical Research Dark Reader DR89X Transilluminator Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6X) Life Technologies Holdings Pte Ltd R0611 Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium Pan BioTech P04-03500 For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads Life Technologies Holdings Pte Ltd 65002 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Magnetic stand for 15ml tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd 12301D DynaMag-15
Magnetic stand for 15ml tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd  12321D DynaMag-2
ThermoMixer Eppendorf 5382 000.015 Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen Life Technologies Holdings Pte Ltd 29986 EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL  Hitachi F8T5/BL  365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum Life Technologies Holdings Pte Ltd 10270106   Components of Hela medium
Formamide Promega H5052   Component in hybridization buffer
G8T5 Sankyo-Denki G8T5 254 nm UV bulb
Glycogen  Life Technologies Holdings Pte Ltd 10814010 Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop Life Technologies Holdings Pte Ltd Nanodrop 2000 Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water  First BASE BUF-1180-500ml  
Penicillin Streptomycin   Life Technologies Holdings Pte Ltd 15140122   Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x) Life Technologies Holdings Pte Ltd F531L  Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1 New England Biolabs E7335L  PCR primers
DNA Gel Extraction Kit QIAgen 28106 QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit Life Technologies Holdings Pte Ltd Q32854 Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit Qiagen 74106 RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor Life Technologies Holdings Pte Ltd AM2696 SUPERase In
Reverse transcriptase Life Technologies Holdings Pte Ltd 18080400 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies Holdings Pte Ltd S11494 SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs M0204L Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373L Enzyme for adaptor ligation
Temed Bio-Rad 1610801 TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform Life Technologies Holdings Pte Ltd 15596018 TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea First BASE BIO-2070-5kg  
UV crosslinker Stratagene 400072 UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator UVP 95-0417-01 For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich X4126-10G
DNA cleanup it Zymo Research  D4004 Zymo DNA concentrator-5 
List of software required
FastQC software 0.11.4 http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software 1.0.7 https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software 0.7.12 http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software 1.2.1 http://www.htslib.org/
PULLSEQ software 1.0.2 https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software 2.5.0c https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script AWK GNU 4.1.2 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer: 
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2X RNA fragmentation buffer
18mM MgCl2
450mM KCl
300mM Tris-CL pH 8.3
2x RNA loading Dye:
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1mM EDTA 
3' RNA adapter sequence 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

References

  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O’Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

Play Video

Cite This Article
Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan, N., Wan, Y. Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen. J. Vis. Exp. (123), e55255, doi:10.3791/55255 (2017).

View Video