Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Het bestuderen van hoe macromoleculen elkaar vouwen en interageren, is de sleutel tot het begrijpen van genregulering in de cel. Hoewel er in het afgelopen decennium veel moeite werd gelegd om te begrijpen hoe DNA en eiwitten bijdragen tot genregulatie, is er relatief minder bekend over posttranscriptie van genexpressie. RNA voert informatie in zowel zijn lineaire volgorde als in zijn secundaire en tertiaire structuur ¹ . Het vermogen om met zichzelf en met anderen te koppelen, is belangrijk voor zijn functie in vivo . Recente vooruitgang in high-through RNA secundaire structuuronderzoek heeft waardevolle inzicht gegeven in de locaties van dubbele en enkelstrengige gebieden in de transcriptome ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howeVer informatie over de pairing interaction partners is nog steeds grotendeels ontbreken. Om te bepalen welke RNA-sequentie in wisselwerking met een ander RNA-gebied in het transcriptomeet is, hebben we wereldwijde paar-wise informatie nodig.

Mapping pair-wise RNA interacties op een globale, onpartijdige manier is traditioneel een grote uitdaging geweest. Terwijl eerdere benaderingen, zoals CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ en RAP ¹¹ , worden gebruikt om RNA-interacties op grote schaal te identificeren, worden deze technieken typisch RNA-basisparen in kaart gebracht voor een subset van RNA's die ofwel interactie hebben met een bepaald eiwit of RNA-soort. Recente ontwikkelingen bij het bestuderen van globale RNA-interacties omvatten de methode RPL ¹² , die geen RNA-interacties in vivo stabiliseert en derhalve alleen een subset van in vivo interacties kan vastleggen. Om deze uitdagingen te overwinnen hebben we en anderen ontwikkeld genoom-brede, onbevooroordeelde strategieën voor maP RNA-interacties in vivo , onder gebruikmaking van gemodificeerde versies van de crosslinkerpsoralen ^{13 , 14 , 15} . In dit protocol beschrijven we de details voor het uitvoeren van S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated en S gekozen H ybrids (SPLASH), die biotinyleerde psoralen gebruikt om RNA's in vivo te crosslinken, gevolgd door proximale ligatie en high-through sequencing naar Identificeer RNA base-pairing partners genoom breed ( figuur 1 ) ¹⁵ .

In dit manuscript beschrijven we de stappen om SPLASH uit te voeren met behulp van gekweekte aanhechtende cellen, in dit geval HeLa-cellen. Hetzelfde protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan suspensie zoogdiercellen en aan gist- en bacteriecellen. In het kort worden HeLa-cellen behandeld met biotinyleerde psoralen en bestraald bij 365 nm om interactie RNA-basisparen in vivo te crosslinken. De RNA's worden dan geëxtraheerd uit de cellen, gefragmenteerd en verrijkt voor verknopingsgebieden onder toepassing van streptavidine kralen. Interactieve RNA-fragmenten worden dan gelijktijdig gelijktijdig gelijktijdig gelegeerd en in een cDNA-bibliotheek gemaakt voor diepvolgorde. Bij sequentiebepaling worden de chimere RNA's op het transcriptoom / genoom toegewezen om de RNA-interactie-gebieden die met elkaar gepaard zijn te identificeren. We hebben SPLASH succesvol gebruikt om duizenden RNA-interacties in vivo te identificeren in gist en verschillende menselijke cellen, waaronder intramoleculaire en intermoleculaire RNA base pairing in diverse klassen van RNA's, zoals snoRNAs, lncRNAs en mRNAs, om te kijken naar de structurele organisatie en interactiepatronen Van RNA's in de cel.