Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas
Summary
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
La purificación de activo proteína-proteína y complejos de proteína-ácido nucleico es crucial para la caracterización de las actividades enzimáticas y de novo identificación de nuevas subunidades y modificaciones post-traduccionales. sistemas bacterianos permiten la expresión y purificación de una amplia variedad de polipéptidos individuales y complejos de proteínas. Sin embargo, este sistema no permite la purificación de subunidades de proteínas que contienen modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, la fosforilación y la acetilación), y la identificación de nuevas subunidades reguladoras que sólo están presentes / expresadas en el sistema eucariota. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de una novela, robusto y eficiente método de purificación por afinidad en tándem (TAP) usando estreptomicina y proteínas bandera de etiquetado que facilita la purificación de complejos de proteínas con proteínas de forma transitoria o estable expresado etiquetadas con epítopo de las células eucariotas. Este protocolo se puede aplicar a caracterizar protein funcionalidad compleja, para descubrir las modificaciones posteriores a la traducción en subunidades complejos, e identificar nuevos componentes complejos de regulación mediante espectrometría de masas. En particular, este método TAP se puede aplicar para estudiar complejos de proteínas formadas por componentes eucariotas o patógenos (virales y bacterianas), produciendo de este modo una amplia gama de oportunidades experimentales aguas abajo. Proponemos que los investigadores que trabajan con complejos de proteínas podrían utilizar este enfoque de muchas maneras diferentes.
Introduction
Interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la regulación precisa de los procesos biológicos 1, y más estudios sobre estos IBP puede informar acerca de su función 2. Varios enfoques se han ideado para el estudio y caracterización de los IBP, así como para la identificación de novo de nuevos componentes de la proteína de regulación. En 1989, Stanley Fields y sus colegas informaron de la levadura de dos híbridos (Y2H) de ensayo 3. Este enfoque permite la identificación imparcial y exhaustiva de interactores (presas) para una proteína de interés definida (cebo) en Saccharomyces cerevisiae. Además de su notable utilidad para el descubrimiento de los IBP, el ensayo Y2H se puede utilizar para la caracterización de pares de proteínas en células de levadura, la definición de dominios que interactúan mínimas, y la identificación de mutaciones que suprimen tales interacciones. Modificando el ensayo Y2H, IBP también puede estudiarse en células de mamíferoclass = "xref"> 4. Las variaciones del ensayo de Y2H (por ejemplo, sistema de levadura de tres híbridos) también se pueden aplicar para estudiar la proteína-ARN y las interacciones ligando orgánico de proteínas pequeñas en las células.
Otra herramienta usada comúnmente para estudiar los IBP en un sistema homólogo es la co-inmunoprecipitación (co-IP) de ensayo 5. Mediante el uso de un anticuerpo para inmunoprecipitar una proteína de interés, el ensayo de co-IP permite a los investigadores monitorizar los IBP en las células para diferentes condiciones ambientales y situaciones experimentales. El uso de proteínas etiquetadas con epítopo (por ejemplo, FLAG, Myc, STREP, y HA, entre otros) en la purificación por afinidad (AP) métodos ha facilitado el aislamiento de proteínas a partir de mezclas complejas de proteínas de varios ensayos de aguas abajo, incluyendo transferencia de Western, tinción de plata , y análisis enzimático. Sin embargo, ninguno de estos enfoques anteriores permiten el aislamiento de grandes cantidades de complejos de proteínas para una caracterización adicional incluyendo in vitro unassays, descubrimiento de subunidades reguladoras por espectrometría de masas, y la identificación de las modificaciones post-traduccionales. Una versión mejorada del método de AP se llama Tandem AP (TAP), que es una técnica de purificación para el estudio de los IBP mediante la creación de una proteína de fusión con dos epítopos que se purifica a través de dos puntos de acceso posteriores 6, 7. En este artículo, se presenta una variación del método de TAP complejos de proteínas de purificación en el que dos subunidades etiquetados con diferentes epítopos y después se purificó a través de dos puntos de acceso secuencial (STREP AP seguido de FLAG IP). En primer lugar, proporcionar una visión minimalista de TAP (Figura 1) y, a continuación una descripción detallada de todos los pasos experimentales (Figura 2), por lo que los investigadores puedan aplicarlas a su complejo de proteína de interés.
Para demostrar la aplicabilidad del método TAP, elegimos un bien caracterizado ciclina-CDK complejo (denominado PTEFB quinasa), que se compone de la ciclina T1 subunidad reguladora (CycT1) y una quinasa (CDK9), y está implicado en la regulación de la transcripción por la ARN polimerasa II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforila el dominio C-terminal de Pol II y sus asociados factores de elongación negativos, lo que alivia la pausa de la transcripción en el promotor y de ese modo facilita la elongación de la transcripción 11, 12, 13. Con esta interacción conocida en mente, Strep-etiquetados CycT1 y CDK9 marcado con FLAG fueron sobreexpresado en células HEK293T. Un experimento recíproco TAP se realizó con CDK9 Strep-etiquetados y la bandera de etiquetado CycT1 para validar además que la interacción de proteínas es independiente de los epítopos utilizados. Las células se recogieron y se lisaron 48 h después de la transfección. El lisado soluble se purificó por TAP (STREP AP seguido por FLAGIP). Entrada y proteínas purificadas se analizaron por Western blot y tinción de plata (Figura 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí para la expresión y el aislamiento de los complejos de proteínas a partir de células eucariotas no se limita a la caracterización bioquímica de tales conjuntos moleculares, pero también puede ser utilizado para la identificación de nuevos interactores y modificaciones posteriores a la traducción que podría regular su función. La utilización de etiquetas de afinidad no se limita a lo que se menciona en este protocolo; pero nuestra experiencia sugiere que el uso de STREP como el prim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
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