Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки
Summary
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
Очистка активного белок-белковых комплексов и белково-нуклеиновых кислот имеет решающее значение для характеристики ферментативной активности и De Novo идентификации новых подразделений и пост-трансляционных модификаций. Бактериальные системы обеспечивают экспрессию и очистку широкого спектра одиночных полипептидов и белковых комплексов. Тем не менее, эта система не позволяет очистку белковых субъединиц , которые содержат посттрансляционные модификации (например, фосфорилирования и ацетилирования), а также выявление новых регуляторных субъединиц, которые присутствуют только в / выраженных в эукариотической системе. Здесь мы приводим подробное описание романа, надежный и эффективный метод очистки тандем сродством (TAP) с использованием септический и FLAG-меченных белков, что облегчает очистку белковых комплексов с временно или стабильно выражается эпитопными меченых белков из эукариотических клеток. Этот протокол может быть применен для характеристики ProtEin комплекс функциональность, чтобы открыть пост-трансляционные модификации на сложных субъединиц, а также определить новые регуляторные сложные компоненты с помощью масс-спектрометрии. Следует отметить, что этот метод ТАР может быть применен для изучения белковых комплексов, образованных эукариотических или патогенными (вирусные и бактериальные) компонентов, получая таким образом широкий спектр ниже по течению экспериментальные возможности. Мы полагаем, что исследователи, работающие с белковыми комплексами могли бы использовать этот подход в самых разных формах.
Introduction
Белок-белковые взаимодействия (ИПП) имеют решающее значение для точного регулирования биологических процессов 1, и дальнейшие исследования по этим ИПН может сообщить об их функции 2. Существует несколько подходов были разработаны для исследования и определения характеристик ИПН, а также для идентификации De Novo новых регуляторных белковых компонентов. В 1989 году Стэнли Филдс и его коллеги сообщили дрожжи двух гибридных (Y2H) анализ 3. Такой подход позволяет беспристрастно и полной идентификации interactors (охотится) для определенного интересующего белка (приманки) в Saccharomyces CEREVISIAE. В дополнение к своей замечательной утилиты для обнаружения ИЦП, анализ Y2H может быть использован для определения характеристик пар белков в дрожжевых клетках, определяя минимальные взаимодействующие домены, а также идентификации мутаций, которые отменяют такие взаимодействия. Изменяя анализа Y2H, ИЦП также могут быть изучены в клетках млекопитающихкласс = "Xref"> 4. Вариации анализа Y2H (например, дрожжи три гибридные системы) , также могут быть применены для изучения белок-РНК и белок-малые органические взаимодействия лиганда в клетках.
Другим часто используемым инструментом для изучения ИЦП в гомологичной системе является со-иммунопреципитации (со-IP) анализ 5. Используя антитела к иммунопреципитации белок, представляющий интерес, анализ со-IP позволяет исследователям контролировать ИЦП в клетках для различных условий окружающей среды и экспериментальных ситуаций. Использование эпитоп-меченных белков (например, FLAG, Мус, STREP и HA, среди прочих) в аффинной очистки (AP) методов способствовало выделение белков из сложных белковых смесей в течение нескольких последующих анализов, в том числе вестерн – блоттинга, серебро пятно и ферментный анализ. Тем не менее, ни один из этих подходов не ранее позволяют выделение больших количеств белковых комплексов для дальнейшей характеристики в том числе в пробиркеssays, открытие регуляторных субъединиц с помощью масс-спектрометрии и идентификации посттрансляционных модификаций. Усовершенствованный вариант метода AP называется Тандем AP (TAP), которая представляет собой метод очистки для изучения ИЦП путем создания гибридного белка с двумя эпитопов , который очищают с помощью двух последующих точек доступа 6, 7. В этой статье мы представляем вариант способа ТАР для очистки белковых комплексов, в которых две субъединицы, помеченных различными эпитопами и затем очищают с помощью двух последовательных точек доступа (AP STREP с последующим FLAG IP). Сначала обеспечить минималистичный обзор TAP (рисунок 1) , а затем подробное описание всех экспериментальных шагов (рисунок 2), так что исследователи могут применить их к белковым комплексом интересов.
Чтобы продемонстрировать применимость метода TAP, мы выбрали хорошо охарактеризованный циклин-CDK комплекс (называемый PTEFB – киназа), который состоит из регуляторной субъединицы циклина Т1 (CycT1) и киназы (CDK9), и участвует в регуляции транскрипции РНК – полимеразы II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb фосфорилирует С-концевой домен Pol II и связанных с ним негативных факторов удлинения, которые снимает транскрипционный приостановку на промотор и тем самым способствует транскрипции удлинение 11, 12, 13. С помощью этого известного взаимодействия в виду, STREP-меченый CycT1 и FLAG-меченый CDK9 были более выражены в клетках HEK293T. Ответный эксперимент TAP проводили с STREP-меченый CDK9 и FLAG-меченый CycT1 для дальнейшей проверки, что взаимодействие белка не зависит от используемых эпитопов. Клетки собирали и лизировали через 48 часов после трансфекции. Растворимый лизат очищали TAP (STREP AP с последующим FLAGIP). Входные и очищенные белки анализировали с помощью Вестерн – блоттинга и серебра пятно (рисунок 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, для экспрессии и выделения белковых комплексов из эукариотических клеток не ограничивается биохимической характеризации таких молекулярных ансамблей, но также могут быть использованы для идентификации новых interactors и посттрансляционных модификаций, котор?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D’Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D’Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D’Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
