جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة
Summary
We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.
Abstract
تنقية نشط البروتين البروتين والمجمعات حمض البروتين النووي هو أمر حاسم لتوصيف الأنشطة الإنزيمية ودي نوفو تحديد الوحدات الفرعية الجديدة والتعديلات بعد متعدية. أنظمة بكتيرية تسمح للتعبير وتنقيتها من مجموعة واسعة من البروتينية واحدة والمجمعات البروتين. ومع ذلك، فإن هذا النظام لا يمكن تنقية مفارز البروتين التي تحتوي على التعديلات بعد متعدية (على سبيل المثال، الفسفرة وأستلة)، وتحديد مفارز التنظيمية الجديدة التي تكون موجودة فقط / أعرب في النظام حقيقية النواة. هنا، ونحن نقدم وصفا مفصلا للرواية، وقوية، وطريقة فعالة لتنقية جنبا إلى جنب تقارب (وات) باستخدام STREP- والبروتينات الموسومة FLAG الذي يسهل عملية تنقية البروتين المجمعات مع عابر أو مستقر أعرب البروتينات الموسومة حاتمة من الخلايا حقيقية النواة. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على تميز بروتعين الوظائف المعقدة، لاكتشاف التعديلات بعد متعدية على مفارز معقدة، وتحديد مكونات معقدة تنظيمية جديدة من خلال قياس الطيف الكتلي. والجدير بالذكر، يمكن تطبيق هذه الطريقة التونسية لدراسة المجمعات البروتين يتكون من مكونات حقيقية النواة أو المسببة للأمراض (الفيروسية والبكتيرية)، وبالتالي مما أسفر عن مجموعة واسعة من الفرص التجريبية المصب. نقترح أن الباحثين العاملين مع المجمعات البروتين يمكن الاستفادة من هذا النهج في العديد من الطرق المختلفة.
Introduction
تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) هي الحاسمة لتنظيم دقيق من العمليات البيولوجية 1، وإجراء المزيد من الدراسات حول هذه مثبطات مضخة البروتون يمكن أن تبلغ عن وظيفتها 2. وقد وضعت عدة نهج لدراسة وتوصيف مثبطات مضخة البروتون وكذلك لدي نوفو تحديد مكونات البروتين التنظيمية الجديدة. في عام 1989، ذكرت ستانلي فيلدز وزملاؤه الخميرة اثنين الهجين (Y2H) فحص 3. يسمح هذا النهج لتحديد متحيز وشامل للinteractors (يفترس) لبروتين محددة من الفائدة (الطعم) في خميرة الخباز. وبالإضافة إلى فائدة ملحوظة من أجل اكتشاف مثبطات مضخة البروتون، وفحص Y2H يمكن استخدامها لوصف أزواج البروتين في خلايا الخميرة، وتحديد مجالات التفاعل الحد الأدنى، وتحديد الطفرات التي إلغاء مثل هذه التفاعلات. عن طريق تعديل فحص Y2H، مثبطات مضخة البروتون يمكن أيضا أن تدرس في خلايا الثديياتالطبقة = "XREF"> 4. ويمكن أيضا أن الاختلافات في فحص Y2H (على سبيل المثال، نظام الخميرة ثلاثة الهجين) يتم تطبيقها على دراسة البروتين RNA والتفاعلات يجند العضوية-بروتين صغير في الخلايا.
أداة أخرى تستخدم عادة لدراسة مثبطات مضخة البروتون في نظام مثلي هي شارك في مناعي (شارك في IP) فحص 5. باستخدام أجسام مضادة لبروتين immunoprecipitate من الفائدة، وفحص المشارك IP يسمح للباحثين لمراقبة مثبطات مضخة البروتون في الخلايا للظروف البيئية المختلفة والحالات التجريبية. استخدام البروتينات الموسومة حاتمة (على سبيل المثال، FLAG، Myc على، بكتيريا، وHA، من بين أمور أخرى) في تنقية تقارب (ا ف ب) طرق سهلت عزل البروتينات من خليط من البروتين المعقدة لعدة فحوصات المصب، بما في ذلك وصمة عار الغربية، وصمة عار الفضة ، وتحليل الأنزيمي. ومع ذلك، فإن أيا من هذه الطرق السابقة يمكن عزل كميات كبيرة من البروتين المجمعات لمزيد من التوصيف بما في ذلك في المختبر لssays، اكتشاف مفارز التنظيمية التي الطيف الكتلي، وتحديد التعديلات بعد متعدية. ويطلق نسخة محسنة من طريقة AP جنبا إلى جنب AP (وات)، وهي تقنية تنقية لدراسة مثبطات مضخة البروتون عن طريق إنشاء بروتين الانصهار مع اثنين من الحواتم التي يتم تنقيته من خلال اثنين من نقاط وصول لاحقة 6 و 7. في هذه المقالة، نقدم الاختلاف في طريقة التونسية للمجمعات البروتين تنقية الذي يتم وضع علامة على وحدتين فرعيتين مع الحواتم مختلفة ثم تنقيته من خلال اثنين من نقاط وصول متسلسلة (بكتيريا AP تليها FLAG IP). علينا أولا تقديم لمحة أضيق الحدود من TAP (الشكل 1)، ثم وصفا مفصلا لجميع الخطوات التجريبية (الشكل 2)، بحيث يمكن للباحثين تطبيقها على بروتين معقد اهتمامهم.
للتدليل على تطبيق هذه الطريقة التونسية، اخترنا جيدا اتسم السيكلين-معلمين المعقدة (ويشار إلى PTكيناز EFB)، التي تتألف من السيكلين T1 فرعية التنظيمية (CycT1) وكيناز (CDK9)، ويشارك في تنظيم النسخ التي كتبها RNA بوليميريز الثاني (بول الثاني) 8 و 9 و 10. ف TEFb phosphorylates المجال سي محطة للبول الثاني وما يرتبط بها من عوامل لها استطالة السلبية، والذي يخفف التوقف النسخي في المروج، وبالتالي يسهل النسخ استطالة 11 و 12 و 13. مع هذا التفاعل المعروف في الاعتبار، بكتيريا الموسومة CycT1 وكانت CDK9 الموسومة FLAG خلال أعرب في الخلايا HEK293T. تم إجراء التجربة التونسية متبادلة مع CDK9 الموسومة بكتيريا والموسومة FLAG CycT1 لمزيد من التحقق من أن التفاعل البروتين مستقلة عن الحواتم المستخدمة. وقد تم جمع الخلايا و lysed 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. تمت تنقية المحللة للذوبان التي كتبها TAP (بكتيريا AP تليها FLAGIP). وقد تم تحليل المدخلات وتنقية البروتينات لطخة الغربية وصمة عار الفضة (الشكل 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول صفها هنا للتعبير عن وعزل بروتين المجمعات من الخلايا حقيقية النواة لا يقتصر على توصيف البيوكيميائية مثل هذه التجمعات الجزيئية، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم لتحديد interactors الجديدة والتعديلات بعد متعدية التي يمكن أن تنظم وظيفتها. لا يقتصر استخدام علامات التقارب إ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D’Orso.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | SH30022FS | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher Scientific | MP091670049 | |
| PolyJet | Fisher Scientific | 50-478-8 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| STREP-Tactin Superflow | IBA | 2-1208-010 | |
| STREP-tag elution buffer | IBA | 2-1000-025 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | SLBQ1981V | |
| Corning 100mm × 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve | Corning | 430167 | |
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Fisher Scientific | 13-698-794 | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 hole micro tube foam rack | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake shaker rotisserie | Thermo | 415110 |
References
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
- Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
- Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
- Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
- Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
- McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D’Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
- D’Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
- McNamara, R. P., Bacon, C. W., D’Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
- Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
- McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
- Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
- Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).
