Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme
Summary
Nöromüsküler kavşak (NMJ) işlevsel bir değerlendirilmesi sinir ve kas arasındaki iletişimi ilgili gerekli bilgileri sağlar. Burada biz kapsamlı bir şekilde kullanarak iki farklı kas-sinir hazırlıklar, yani soleus siyatik ve diyafram frenik NMJ ve kas işlevselliğini değerlendirmek için bir protokol tanımlamak.
Abstract
Nöromüsküler kavşak (NMJ) işlevselliği motor nöron ve kas arasındaki iletişimi, yaşlanma ve amyotrofik lateral skleroz (ALS) gibi Engelli olduğu hastalıklar okurken çok önemli bir rol oynar. Burada iki tür elektriksel stimülasyon birleştirerek NMJ işlevselliği ölçmek için kullanılan bir deneysel protokol tarif: doğrudan kas zarı stimülasyon ve stimülasyon sinir aracılığıyla. Bu iki farklı elektrodlar kas cevaben karşılaştırılması işlev düzeyinde fonksiyonel kas düşüş yol olası değişiklikler NMJ içinde tanımlamak için yardımcı olabilir.
Ex vivo hazırlıkları iyi kontrollü çalışmalar için uygundur. Burada tarif biz kas ve NMJ işlevselliği soleus siyatik sinir hazırlık ve diyafram frenik sinir hazırlık birkaç parametrelerini ölçmek için yoğun bir iletişim kuralı. Protokol yaklaşık 60 dakika sürer ve kesintisiz bir ısmarlama aracılığıyla yapılır seğirme Kinetik özellikleri, sinir ve kas elektrodlar için güç frekanslı ilişki ve iki parametre NMJ işlevselliği için belirli Yani neurotransmission yetmezliği ve intratetanic yorgunluk ölçer yazılım. Bu metodoloji hasar soleus ve diyafram kas-sinir hazırlıkları SOD1G93A transgenik fare, ubiquitously mutant antioksidan enzim süperoksit dismutaz 1 (SOD1) overexpresses ALS deneysel bir model kullanarak bulmak için kullanıldı.
Introduction
Nöromüsküler kavşak (NMJ) kas fiber motor endplate ve motor nöron axon terminal arasında bağlantı oluşturduğu bir kimyasal synapse var. Kas ve sinir arasındaki iletişim, yaşlanma veya amyotrofik lateral skleroz (ALS) gerçekleştiği sırada bozulmuş olduğunda çok önemli bir rol oynamaya NMJ gösterilmiştir. Kas ve sinir bir çift yönlü yol1,2‘ olarak, NMJ kusurları kas defektleri dan ayrı olarak ölçmek için güçlü olmak onların Fizyopatolojik Interplay yeni görüşler sağlayabilir. Gerçekten de, bu işlevsel değerlendirme morfolojik ya da biyokimyasal değişiklikler işlevselliği sinyal neurotransmission azaltmak değerlendirmek için yardımcı olabilir.
Kas contractile yanıt sinir stimülasyonu ve onun membran doğrudan uyarılması tarafından uyarılmış aynı kas yanıt elde edildi karşılaştırılması NMJ işlevselliği dolaylı bir ölçüm evlenme teklif etti. Gerçekten de, sinyal membran stimülasyon geçer tarafından neurotransmission beri iki contractile yanıt-e doğru tüm farklılıkları NMJ değişikliklere atfedilen. Bu yaklaşım yaygın olarak fareler3,4,5,6,7için önerilen ve ayrıca fare modelleri8tarihinde,9,10,11,12bilgi toplamak için kullanılır.
Burada, tüketim ve soleus siyatik ve diyafram frenik hazırlıkları iki kas-sinir hazırlıklar, yani sınamak için bir yordam ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bir özel kullanarak yazılım, biz tasarlanmış işlevsellik, NMJ ve kas karakterize birkaç parametre ölçümü birleştirir sürekli bir test Protokolü böylece NMJ hasar kapsamlı bir değerlendirme ayrı ayrı bu kas verimli. Özellikle, protokol seğirme gücü, kas Kinetik, kuvvet-frekans eğrisi için doğrudan ve sinir elektrodlar, hem bir ateş ve tetanic sıklık ve intratetanic yorgunluk7neurotransmission başarısızlık13 ölçer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda açıklanan deneysel protokol ölçme ve doğrudan kas veya meydana gelen herhangi bir işlevsel değişiklikler ayrımcılık dolaylı olarak nöromüsküler kavşak düzeyinde ideal bir yol sağlar. Bu teknik NMJ işlevselliği dolaylı bir ölçüm üzerinde dayalı olduğundan, herhangi bir kusur morfolojik değişiklikler veya biyokimyasal değişiklikler ile ilişkili Eğer kurmak için kullanılamaz. Buna karşılık, herhangi bir morfolojik ya da biyokimyasal değişiklikler işlevselliği sinyal neurot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarların laboratuvar çalışmalarında Fondazione Roma ve televizyon dizisi tarafından (Hayır ver. desteklenmiştir GGP14066).
Materials
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Potassium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ | AnalaR | 7778-77-0 | |
| Magnesium sulphate MgSO₄ | AnalaR | 7487-88-9 | |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors – 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. . Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
