Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular
Summary
Uma avaliação funcional da junção neuromuscular (JNM) pode fornecer informações essenciais sobre a comunicação entre o músculo e do nervo. Aqui descrevemos um protocolo para avaliar exaustivamente o músculo e o MNJ funcionalidade usando duas preparações diferentes de nervo-músculo, ou seja, sóleo-isquiático e frênico-diafragma.
Abstract
Funcionalidade de junção neuromuscular (JNM) desempenha um papel crucial ao estudar as doenças em que a comunicação entre neurônio motor e músculo é prejudicada, como envelhecimento e esclerose lateral amiotrófica (ela). Aqui descrevemos um protocolo experimental que pode ser usado para medir a funcionalidade MNJ combinando dois tipos de estimulação elétrica: direto de estimulação da membrana muscular e a estimulação através do nervo. A comparação da resposta muscular para esses dois estímulos diferentes pode ajudar a definir, a nível funcional, potenciais alterações no MNJ que levam ao declínio funcional no músculo.
Preparações dex vivo E são adequadas para estudos bem controlados. Aqui descrevemos um protocolo intensivo para medir vários parâmetros do músculo e funcionalidade Nicotínico para a preparação do nervo isquiático-sóleo e para a preparação nervo frênico-diafragma. O protocolo dura aproximadamente 60 minutos e é realizado ininterruptamente por meio de uma custom-made software que mede as propriedades de cinética de contração muscular, a relação força-frequência de estimulação do músculo e do nervo e dois parâmetros específicos para a funcionalidade de JNM, ou seja, falha de neurotransmissão e fadiga intratetanic. Esta metodologia foi utilizada para detectar danos em preparações de nervo-músculo sóleo e diafragma usando SOD1G93A mouse transgénico, um modelo experimental de ALS que ubiquitously overexpresses o mutante antioxidante da enzima superóxido dismutase 1 (SOD1).
Introduction
Junção neuromuscular (JNM) é uma sinapse química formada pela conexão entre a placa terminal motor da fibra muscular e o axônio do neurônio motor terminal. O MNJ foi mostrado para jogar um papel crucial, quando a comunicação entre o músculo e do nervo é prejudicada, como ocorre no envelhecimento ou esclerose lateral amiotrófica (ela). Como o músculo e nervo comunicar-se em uma maneira de bidirecional1,2, sendo capaz de medir defeitos MNJ separadamente do músculo defeitos pode fornecer novos insights sobre sua interação fisiopatológica. Com efeito, esta avaliação funcional pode ajudar a avaliar se alterações morfológicas ou bioquímicas reduzem neurotransmissão funcionalidade de sinalização.
A comparação da resposta contrátil muscular, provocada pela estimulação do nervo e a resposta do mesmo músculo evocado por estimulação direta de sua membrana tem sido proposta como uma medida indireta da funcionalidade do MNJ. Com efeito, desde a membrana neurotransmissão de by-pass de estimulação sinalização, quaisquer diferenças nas duas respostas contráteis podem são imputáveis mudanças no MNJ. Esta abordagem foi extensivamente proposta para ratos3,4,5,6,7e também usada para reunir informações sobre modelos de rato8,9,10,11,12.
Aqui, descrevemos em detalhe um procedimento para excisar e testar duas preparações nervo-músculo, i. e. as preparações sóleo-isquiático e frênico-diafragma. Usando um Custom-Made software, nós projetamos um protocolo de teste contínuo que combina a medição de vários parâmetros que caracterizam a funcionalidade tanto Mioneural e músculo, desse modo, produzindo uma avaliação abrangente dos prejuízos MNJ separadamente do músculo. Em particular, o protocolo mede a força de contração muscular, a cinética de músculo, a curva força-frequência para direta e estímulos nervosos, a neurotransmissão falha13 para um despedimento e as frequências tetânica e a fadiga intratetanic7.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo experimental descrito acima fornece uma maneira ideal de medir e discriminar qualquer alterações funcionais ocorridas diretamente no músculo ou indirectamente a nível da junção neuromuscular. Uma vez que esta técnica baseia-se em uma medida indireta da funcionalidade de JNM, não pode ser usado para determinar se qualquer defeito está relacionado às alterações morfológicas ou a alterações bioquímicas. Por outro lado, ele fornece uma maneira eficaz de determinar se as alterações morfológicas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabalho no laboratório dos autores foi apoiado pela Fondazione Roma e Teleton (conceder n. GGP14066).
Materials
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Potassium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ | AnalaR | 7778-77-0 | |
| Magnesium sulphate MgSO₄ | AnalaR | 7487-88-9 | |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors – 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
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