神経筋接合部機能を測定
Summary
神経筋接合部 (NMJ) の機能評価は、筋肉と神経の間の通信に不可欠な情報を提供できます。ここで使用して 2 つの異なる筋神経剤、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔 NMJ と筋肉の両方の機能を総合的に評価するためのプロトコルについて述べる。
Abstract
神経筋接合部 (NMJ) 機能は運動ニューロンと筋肉の間の通信障害、加齢、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの病気を勉強して極めて重要な役割を果たしています。ここで述べる NMJ 機能を電気刺激の 2 つのタイプを組み合わせることで測定するために使用することができます実験的プロトコル: 筋膜刺激と神経を通して刺激を直接します。これらの 2 つの異なる刺激に対する筋反応の比較は、筋肉の機能低下につながる略記で潜在的な変化の機能レベルで定義する助けることができます。
Ex vivo準備はよく統制された研究に適しています。ここで筋肉と NMJ 機能ヒラメ坐骨神経の準備のため、ダイヤフラム横隔神経の準備のためのいくつかのパラメーターを測定するための集中的なプロトコルについて述べる。プロトコルは約 60 分を持続し、カスタムメイドによる間断なく行われている収縮動態特性、筋肉や神経の刺激の力周波数の関係と 2 つパラメーター NMJ 機能に固有すなわち神経伝達障害と intratetanic の疲労を測定するソフトウェア。この方法論は、SOD1G93Aトランスジェニック マウス、普遍的突然変異体の抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) を染色 ALS の実験モデルを用いたヒラメ筋と横隔膜筋の準備で損害を検出する使用されました。
Introduction
神経筋接合部 (NMJ) は、筋線維の運動終板と運動ニューロンの軸索の端末間の接続によって形成される化学シナプスです。略記は、筋肉と神経との間の通信が高齢化や筋萎縮性側索硬化症 (ALS) が発生すると、障害に重要な役割を再生する示されています。筋肉や神経は、双方向の方法1,2通信、筋肉奇形とは切り離して NMJ 欠陥を測定することができるという、physiopathological の相互作用に新たな洞察があります。確かに、この機能の評価は、形態や生化学的変化を減らす神経伝達機能を伝達するかどうかを評価するために役立つことがあります。
神経刺激と同じ筋に、膜の直接刺激によって誘発される応答による筋収縮反応の比較は NMJ 機能の間接測定として提案されています。確かに、膜刺激パスによって神経伝達シグナル、以来 2 つの収縮応答の違いと思われる略記で変更します。このアプローチをラット3,4,5,6、7、広く提案されており、またマウス モデル8,9,10、11,12に関する情報を収集するために使用します。
ここでは、私たちは消費税し、2 つの筋の準備、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔の準備をテストする手順の詳細に説明します。特注を使用してソフトウェア、考案した NMJ と筋肉の両方の機能を特徴付けるいくつかの測定を組み合わせた連続的なテスト プロトコルそれにより筋肉の別々 に NMJ 損傷の包括的な評価を降伏します。特に、収縮力と筋の動態、直接力周波数曲線, 神経刺激、発砲とテタヌス周波数と intratetanic 疲労7の両方の神経伝達障害13プロトコルを測定します。
Protocol
All the animal experiments were approved by the ethics committee of Sapienza University of Rome-Unit of Histology and Medical Embryology and were performed in accordance with the current version of the Italian Law on the Protection of Animals. 1. Experimental set-up Set-up the experimental system composed of 1 actuator/transducer, 2 stimulators, 1 in-vitro muscle apparatus, 1 preparatory tissue bath, 1 suction electrode, 1 digital oscilloscope, 1 stereomicroscope, 1 cold l…
Representative Results
我々 が説明されたプロトコルでは、いくつかの神経筋疾患や老化サルコペニア機能神経について説明します。かどうか (その場合は、どのレベルで) は、このプロトコルを使用することができます筋肉の変化がそれ自体筋肉または神経筋伝達で発生する選択の変更によるものです。下図のデータは、我々 グループの18、20疾患の末期…
Discussion
上記実験のプロトコルは、測定、差別または筋肉に直接に発生した任意の機能変化間接的神経筋接合部のレベルでの理想的な方法を提供します。この手法は NMJ 機能の間接測定に基づいているので、かどうか瑕疵は形態学的変化または生化学的変化に関係を確立する使用できません。対照的に、任意の形態学的または生化学的変化が神経伝達シグナルの機能を減らしたかどうかを決定するの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
筆者らの研究室で仕事に支えられたスタンパーリアラヴェッロ ローマ、テレソン (付与なし。GGP14066)。
Materials
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Potassium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ | AnalaR | 7778-77-0 | |
| Magnesium sulphate MgSO₄ | AnalaR | 7487-88-9 | |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors – 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. . Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
Tags
Neuromuscular Junction FunctionalityEx Vivo Experimental ApproachMuscle Nerve PreparationMembrane StimulationNerve StimulationContractile ResponsesSoleus Sciatic Nerve PreparationForce And Length ControllerPlatinum ElectrodesGlass Suction ElectrodeTesting ProtocolMuscle FunctionalityPathological ConditionsKrebs-Ringer SolutionGas MixtureActuator TransducerPulse StimulatorsMuscle MembraneNerve StimulationSacrificingCervical DislocationGastrocnemius MuscleSoleus MuscleProximal Tendon
Cite This Article
Rizzuto, E., Pisu, S., Nicoletti, C., Del Prete, Z., Musarò, A. Measuring Neuromuscular Junction Functionality. J. Vis. Exp. (126), e55227, doi:10.3791/55227 (2017).