מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר
Summary
הערכה תפקודית של צומת עצב-שריר (NMJ) יכול לספק מידע חיוני על התקשורת בין שריר ועצב. כאן נתאר פרוטוקול להעריך באופן מקיף פונקציונליות NMJ והן שריר באמצעות שני תכשירים שריר-עצב שונים, קרי הסוליה-פציעה, דיאפרגמה-הסרעפת.
Abstract
צומת עצב-שריר (NMJ) פונקציונליות ממלא תפקיד מרכזי כשלמדתי מחלות בהן התקשורת בין נוירון מוטורי השריר הוא לקוי, כגון הזדקנות נוירודגנרטיביות (ALS). כאן נתאר טיפול נסיוני זה יכול לשמש כדי למדוד NMJ פונקציונליות על ידי שילוב של שני סוגים של גירוי חשמלי: ישיר שריר ממברנה גירוי, הגירוי דרך העצב. השוואת השריר בתגובה stimulations שונים שני אלה יכולים לעזור להגדיר, ברמה תפקודית, שינויים NMJ פוטנציאל להוביל לירידה תפקודית בשריר.
Ex vivo תכשירים מתאימים ללימודים ומבוקרות היטב. כאן נתאר פרוטוקול אינטנסיבית כדי למדוד את מספר הפרמטרים של שריר ופונקציונליות NMJ עבור הכנת עצב הסוליה-פציעה, הכנת עצב הסרעפת-הסרעפת. הפרוטוקול נמשך כ- 60 דקות, והוא מנוהל רציפה ותקינה של בעלי על-ידי מחוייט תוכנה המודדת את המאפיינים קינטיקה עווית הגומלין בתדר כוח עבור שריר וגם עצב stimulations, שני פרמטרים ספציפיים NMJ פונקציונליות, קרי עצבית כשל ועייפות intratetanic. מתודולוגיה זו נעשה שימוש כדי לזהות נזקים בהכנות עצב-שריר הסוליה והסרעפת באמצעות העכבר הטרנסגניים SOD1G93A , מודל ניסיוני של ALS זה ubiquitously overexpresses את חמצון מוטציה האנזימים סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1).
Introduction
צומת עצב-שריר (NMJ) היא סינפסה כימית שהוקמה על ידי הקשר בין את motor endplate של סיבי השריר הדנדריטי לאקסון מוטור נוירון מסוף. NMJ הוכח לשחק תפקיד מכריע כאשר התקשורת בין שריר עצב הוא לקוי, כמו הזדקנות או נוירודגנרטיביות (ALS). כמו שריר ועצב לתקשר דו-כיוונית דרך1,2, היכולת למדוד פגמים NMJ בנפרד מן השריר פגמים עשויים לספק תובנות חדשות הגומלין physiopathological שלהם. אכן, הערכה תפקודית זו עשוי לעזור כדי להעריך אם שינויים מורפולוגיים או ביוכימי להפחית עצבית איתות פונקציונליות.
ההשוואה של שריר כויץ תגובה שהפיק גירוי עצבי ואת התגובה של אותו שריר עורר על ידי גירוי ישיר של הממברנה שלו הוצע כמו מדידה עקיפות של NMJ פונקציונליות. ואכן, מאז ממברנה גירוי על ידי עובר עצבית איתות, ייתכן ולשייך כל ההבדלים ביומן שתי התגובות כויץ לשינויים ב- NMJ. גישה זו יש בהרחבה תעצומ חולדות3,4,5,6,7, והוא משמש גם כדי לאסוף מידע על העכבר מודלים8,9,10,11,12.
כאן, אנו מתארים בפרוטרוט הליך בלו ולבדוק שני שריר-עצב ההכנות, כלומר את ההכנות הסוליה-פציעה, דיאפרגמה-הסרעפת. שימוש של מחוייט תוכנה, עיצבנו פרוטוקול בדיקה רציפה המשלבת את המדידה של מספר פרמטרים המאפיינות פונקציונליות NMJ והן שריר, ובכך מניב הערכה מקיפה של נזק NMJ בנפרד מזה של השריר. בפרט, הפרוטוקול מודד הכוח עווית, קינטיקה של שרירים, עקומת כוח-תדירות עבור ישיר, עצב stimulations, כשל עצבית13 פיטורים ואת התדרים tetanic, וגם את עייפות intratetanic7.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול הניסוי המתואר לעיל מספק דרך אידיאלית של מדידת וברמת להפלות שינויים פונקציונליים שהתרחשו ישירות בשריר או בעקיפין צומת עצב-שריר. מאז טכניקה זו מבוססת על מדידה עקיפות של פונקציונליות NMJ, זה לא יכול לשמש כדי לקבוע אם כל פגם קשורה שינויים מורפולוגיים או שינויים ביוכימיים. לעומת זאת, ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה במעבדה של המחברים נתמכה על ידי רומא דל’אנג’לו ולהעניק הטלויזיונית (לא. GGP14066).
Materials
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Potassium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ | AnalaR | 7778-77-0 | |
| Magnesium sulphate MgSO₄ | AnalaR | 7487-88-9 | |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors – 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. . Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
