Meten van de motorische eindplaat functionaliteit
Summary
Een functionele evaluatie van de motorische eindplaat (NMJ) kan verschaffen essentiële informatie over de communicatie tussen spieren en zenuwen. Hier beschrijven we een protocol uitvoerig evalueren zowel de spier de NMJ functionaliteit met behulp van twee verschillende spier-zenuw preparaten, d.w.z. soleus-ischialgie en membraan-phrenic.
Abstract
Functionaliteit van de motorische eindplaat (NMJ) speelt een cruciale rol bij de studie van de ziekten waar de communicatie tussen motor neuron en spier met gezichtsstoornissen, zoals veroudering en Amyotrofische laterale sclerose (ALS is). Hier beschrijven we een experimenteel protocol dat kan worden gebruikt voor het meten van NMJ functionaliteit door het combineren van twee soorten elektrische stimulatie: directe spierstimulatie membraan en de stimulatie door middel van de zenuw. De vergelijking van de spier reactie op deze twee verschillende stimulaties kunnen worden gedefinieerd, op het functionele niveau, mogelijke veranderingen in de NMJ die tot daling van de functionele in spier leiden.
Ex vivo preparaten zijn geschikt voor goed gecontroleerde studies. Hier beschrijven we een intensieve protocol voor het meten van verschillende parameters van spier- en NMJ functionaliteit voor de soleus-ischialgie zenuw voorbereiding alsmede voor de bereiding van de membraan-phrenic zenuw. Het protocol duurt ongeveer 60 minuten en onafgebroken wordt uitgevoerd door middel van een op maat gemaakte software die de kramp kinetiek eigenschappen, de relatie van de kracht-frequentie voor zowel spieren en zenuw stimulaties en twee parameters specifiek voor NMJ functionaliteit, d.w.z. transmissie storing en intratetanic vermoeidheid meet. Deze methode werd gebruikt voor het detecteren van schade in de soleus en het middenrif spier-zenuw preparaten met behulp van SOD1G93A transgene muis, een experimenteel model van ALS dat overal overexpresses de mutant anti-oxidant enzym superoxide dismutase 1 (SOD1).
Introduction
De motorische eindplaat (NMJ) is een chemische synapse gevormd door de verbinding tussen de motorische eindplaat van de spiervezel en de motor neuron axon terminal. De NMJ heeft aangetoond dat een cruciale rol spelen bij communicatie tussen spieren en zenuwen aangetast is, zoals gebeurt in veroudering of Amyotrofische laterale sclerose (ALS). Zoals spieren en zenuwen in een bidirectionele manier1,2 communiceren, zijnde kundig voor meten NMJ gebreken los van spier gebreken kunnen nieuwe inzichten in hun pathofysiologische samenspel. Inderdaad, deze functionele evaluatie kan helpen om te beoordelen of morfologische of biochemische veranderingen verminderen transmissie signalering van functionaliteit.
De vergelijking van spier contractiele reactie ontlokte door zenuwstimulatie en de reactie van de dezelfde spier opgeroepen door directe stimulatie van het membraan is voorgesteld als een indirecte meting van NMJ functionaliteit. Inderdaad, sinds membraan stimulatie door-pasjes transmissie signalering, eventuele verschillen in de twee contractiele reacties kunnen worden toegeschreven aan veranderingen in de NMJ. Deze aanpak is uitgebreid voorgesteld voor ratten3,4,5,6,7, en ook gebruikt om informatie te verzamelen over muis modellen8,9,10,11,12.
Hier beschrijven we in detail een procedure voor accijnzen en testen van twee spier-zenuw preparaten, d. w. z. de soleus-ischialgie en membraan-phrenic voorbereidingen. Met behulp van een op maat gemaakte software, we ontwierpen een continu testen protocol dat combineert de meting van de verschillende parameters die kenmerkend zijn voor zowel NMJ en spier-functionaliteit, waardoor opbrengst een uitgebreide evaluatie van NMJ schade apart van die van de spier. Met name meet het protocol de twitch force, de kinetiek van de spier, de kracht-frequentie curve voor directe en zenuw stimulaties, de transmissie storing13 voor zowel een afvuren en de tetanic frequenties en de intratetanic vermoeidheid7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het experimentele protocol hierboven beschreven biedt een ideale manier van meten en discriminerende functionele wijzigingen die hebben plaatsgevonden in de spier direct of niet indirect op het niveau van de motorische eindplaat. Aangezien deze techniek is gebaseerd op een indirecte meting van NMJ functionaliteit, kan het niet worden gebruikt om vast te stellen als een defect is gerelateerd aan morfologische veranderingen of aan biochemische veranderingen. Daarentegen biedt het een effectieve manier om te bepalen of wijz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Werk in de auteurs laboratorium werd gesteund door de Fondazione Roma en Telethon (verlenen neen. GGP14066).
Materials
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Potassium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ | AnalaR | 7778-77-0 | |
| Magnesium sulphate MgSO₄ | AnalaR | 7487-88-9 | |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors – 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. . Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
