Développement d'un ADN Système économique Livraison par « Acufection » et son application à la recherche de la peau
Summary
Ce protocole est une alternative rentable pour exprimer l'ADN plasmidique nu dans la peau de la souris. L'objectif général du protocole est de délivrer des gènes liées au système immunitaire dans le tissu de la peau pour délimiter le rôle fonctionnel d'un gène spécifique dans l'inflammation cutanée.
Abstract
Dysrégulation de la réponse immunitaire dans la peau est associée à de nombreux troubles de la peau humaine. transfert direct de gènes liées au système immunitaire dans les tissus de la peau est une approche fascinante pour étudier la modulation immunitaire de l'inflammation cutanée dans les modèles de souris de maladies humaines. Nous présentons ici un protocole rentable qui a livré l'ADN nu dans la peau de la souris et conduit à l'expression du transgène. Le procédé est inventé « acufection », désignant l' ADN trans fection acu à médiation par la perforation. Pour effectuer acufection, la peau de souris a été perfusée avec de l'ADN dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ensuite piquer légèrement avec un faisceau d'aiguilles d'acupuncture pour faciliter l'absorption de l'ADN et la transfection dans les cellules. L'ADN plasmidique est sans doute repris par le kératinocyte et les cellules dendritiques (CD) dans la peau et exprimé en protéine. Piqûre mécanique avec les aiguilles en tant que tel n'a pas causé de dommages à la peau ou induire l' activation des kératinocytes. L'expressiondes gènes transfectés a été détecté dans la peau à la fois des niveaux transcriptionnels et traductionnels suivants acufection pendant 2 jours et maintenus jusqu'à 7 jours. L'objectif principal pour le développement de cette méthode de acufection était d'étudier une isoforme précédemment définie de l'IL-15. En utilisant cette méthode, une IL-15 isoforme de l'exon 7 (IL-15ΔE7) partiellement supprimé alternativement épissé a été exprimée dans la peau et ensuite traité avec un récepteur de type Toll 7 agoniste (TLR7), imiquimod (IMQ), pour induire une inflammation. IL-15ΔE7 livré Acufection en peau supprimé la prolifération des kératinocytes, l'épaisseur de l'épiderme et le recrutement de neutrophiles dans l'inflammation cutanée induite par IMQ. Avec l'intérêt croissant pour identifier les mécanismes de régulation de l' inflammation cutanée, le protocole décrit ici fournit une alternative rentable et polyvalent pour le système de canon à gènes ou microseeding pour la délivrance d'ADN in vivo. Il peut potentiellement permettre la découverte de la fonction d'un romangène dans la peau ou pour enquêter sur un nouveau traitement pour les maladies cutanées.
Introduction
La peau est la première ligne de défense de l'hôte. Kératinocvtes (KCS) sont le principal type de cellules dans la peau des humains et des souris. En réponse à des stimuli de l' environnement (par exemple la lumière du soleil, de l' oxygène, les produits chimiques et l' invasion pathogène), KCs sont activés et produisent une grande variété de cytokines et de chimiokines pro – inflammatoires telles que l' IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF – a α et GM-CSF 1. Ensemble, ils déclenchent le recrutement de cellules immunitaires de la peau. Aggravé l' inflammation cutanée est souvent associée à de nombreuses maladies humaines , y compris la dermatite de contact extra – utérine aiguë et l' inflammation T à médiation cellulaire chronique (par exemple la dermatite de contact allergique et le psoriasis) 2. La modulation des réponses pro-inflammatoires dans la peau en inhibant l'activation KC est une approche plausible pour traiter l'inflammation cutanée. Ce protocole décrit une nouvelle approche pour exprimer transitoirement un gène de cytokine dans l'épiderme afin d'étudier res immunitairesponse en conséquence un tel traitement de la peau.
L'épiderme compose la couche la plus superficielle de la peau. Il sert de barrière physique en gardant des substances externes, tels que des acides nucléiques et des agents pathogènes de pénétrer dans les couches profondes de la peau. Plusieurs techniques sans aiguille ont été établies pour le transfert d'ADN de l' épiderme 3, 4. ADN en solution ou associés à des liposomes cationiques ou des vecteurs d'adénovirus a été directement appliqué sur l'épiderme modifiés par des techniques telles que l'élimination de la couche cornée ou le traitement avec un réactif d'épilation. L' élimination de l'épithélium kératinisé facilite l' ADN traversant la barrière épidermique et l' interaction avec les kératinocytes et les cellules de Langerhans pour induire des réponses immunitaires 5. Alors qu'une grande surface est disponible pour le transfert d'ADN et cette approche ne comporte pas d'aiguilles, il y a des inconvénients, y compris l'exigencepour les grandes quantités d'ADN (10 à 100 ug), le traitement dure sur la peau par décapage, et les résultats incohérents dans l' induction d'une réponse immunitaire chez les animaux immunisés sans assistance de délivrance d'ADN 6. L' administration intracellulaire à médiation microparticule d'ADN nu à la peau a été montré très efficace et reproductible pour induire une réponse immunitaire 7, 8. Un canon à gènes tenu à la main a été utilisé pour bombarder le site cible de la peau avec le plasmide particules d'or enrobées d' ADN 2 um de diamètre en taille au moyen d'écoulement d'air de l' hélium sous pression 9. L'ADN plasmidique est probablement absorbé par les cellules dendritiques KCsand (CD) dans la peau et la protéine est exprimée localement ou transporté à ganglions lymphatiques drainants par les CD 10. Bien que le système de canon à gènes est simple et nécessite une expérience technique limitée, le coût pour la préparation et la livraison des "ADN bullaisser "( par exemple des poudres d'or, gaz d'hélium) et pour le canon de gène lui – même a limité son application générale. En outre, l'exigence d'un système de distribution de gaz d'hélium limite la facilité du transport des armes à feu génétique lorsque les expériences sont menées à des endroits différents. Microseeding a été démontrée pour parvenir à une plus grande efficacité de transfert de gène à injection unique et un bombardement de particules 11. Microseeding utilise un pistolet de tatouage pour délivrer l' ADN de la peau sans l'utilisation de perles de particules 11. oscillante microaiguilles sur la peau en utilisant cette approche est susceptible de gratter directement la membrane cellulaire et ainsi transférer l'ADN à plusieurs cellules en même temps. Cependant, la douleur associée au grand nombre d'injections avec des aiguilles 0,254 mm de diamètre est un inconvénient.
Nous fournissons ici une approche alternative à la livraison d'ADN in vivo. Le « acufection » </strong> protocole que nous avons décrit ici est un moyen économique et efficace pour fournir l'ADN plasmidique dans la peau de la souris. En bref, dix aiguilles d'acupuncture (0,2 mm de diamètre x 13 mm de longueur) ont été liés dans un faisceau par un ruban adhésif. Un volume de 10 ul de PBS avec 10 pg d'ADN de plasmide contenant le transgène d'intérêt a été placé sur la peau rasée, le flanc traité crème dépilatoire. En utilisant le faisceau d'aiguilles d'acupuncture pour faire osciller la surface (1 cm x 1 cm) de la peau, les kératines dans la couche cornée ont été desserrés et l'ADN plasmidique appliquée à la surface a été absorbé dans l'épiderme. Les lésions cutanées a été surveillée et jugée minime. L'expression du gène transfecté dans la peau acufected a été confirmée à la fois par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et ELISA. Les effets modulateurs immunitaires de l' IL-15ΔE7 rendu de acufection-cutanée sur l' inflammation ont été démontrées en utilisant le modèle de souris traitées IMQ-12. Alors que acufection se révèle être une dema facile et moinsProcédé nding pour la délivrance d'ADN in vivo, la quantité optimale d'ADN de différents gènes et les temps de piquer la peau doivent être soigneusement optimisées pour obtenir des résultats reproductibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'étape la plus critique pour assurer l'expression de l'ADN de plasmide est acufected à osciller de manière uniforme et desserrer la couche cornée de la peau. Tout en poussant les aiguilles doucement sans couper la peau, la force devrait être assez dur pour appuyer sur la surface. Afin de faciliter l'absorption de l'ADN dans une solution de 10 ul sur un 1 cm x surface de 1 cm, les aiguilles doivent osciller vers le haut et vers le bas pour environ 100 fois dans les 30 s. On peut déterminer la f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention du ministère de la Science et de la technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Nous remercions les Drs. Betty Wu-Hsieh et Chien-Kuo Lee à NTU, Leigh Zerboni à l'Université de Stanford et le Dr Peter Hoffmann à l'Université de Hawaii pour lire le manuscrit, Yun Chien à NTU pour l'assistance technique, et le Dr Wen-Chi Wei à la biotechnologie agricole Centre de recherche à l'Academia Sinica pour des conseils techniques.
Materials
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| QIAGENⓇ Plasmid Midi Kit | QIAGEN | 12143 | Purification of plasmid DNA from E. coli |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
| ScanScopeⓇ XT | Aperio | N/A | Whole-field image scanner |
| MetaMorphⓇ Research Imaging | Molecular Devices | N/A | Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells |
References
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