Método de muestreo hisopo para la Detección de norovirus humano en superficies
Summary
A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.
Abstract
norovirus humanos son una causa principal de la epidemia y la gastroenteritis esporádica en todo el mundo. Debido a que la mayoría de las infecciones se propagan ya sea directamente a través de la ruta de persona a persona o indirectamente a través de las superficies ambientales o alimentos, fómites contaminados y superficies inanimadas son vehículos importantes para la propagación del virus durante los brotes de norovirus.
Desarrollamos y evaluamos un protocolo utilizando hisopos macroespuma para la detección y tipificación de los norovirus humanos de las superficies duras. En comparación con hisopos con punta de fibra o toallitas antiestáticas, hisopos macroespuma permiten la recuperación de virus (rango de 1,2 a 33,6%) de las superficies de asiento de inodoro de hasta 700 cm 2. El protocolo incluye los pasos para la extracción del virus de los hisopos y una mayor concentración del ARN viral usando columnas de centrifugación. En total, 127 (58,5%) de 217 muestras de frotis que habían sido recogidos de las superficies en los cruceros y centros de atención a largo plazo donde había estado la gastroenteritis por norovirusinformaron dado positivo por norovirus GII por RT-qPCR. De estos 29 (22,8%) podría ser genotipo con éxito. En conclusión, la detección de norovirus en superficies ambientales utilizando el protocolo que hemos desarrollado puede ayudar a determinar el nivel de contaminación del medio ambiente durante los brotes, así como la detección de virus cuando las muestras clínicas no están disponibles; también puede facilitar el seguimiento de la eficacia de las estrategias de remediación.
Introduction
Norovirus humanos son una causa principal de la epidemia y la gastroenteritis aguda esporádica en todo el mundo 1, 2, 3. El virus es muy contagioso y la transmisión ocurre a través de la interacción persona directa a persona o indirectamente por contacto con alimentos contaminados, agua o superficies ambientales. Los norovirus se pueden desprender durante períodos prolongados y prolongan la supervivencia del virus en las superficies ambientales se ha documentado 1, 2, 3. Durante derramamiento pico, miles de millones de partículas de virus son liberadas por gramo de heces, y vómito también contiene un número suficiente de partículas virales para causar la infección 4, 5, 6, 7, 8,ef "> 9, 10. Además, la transferencia del virus entre las superficies inanimadas y la piel humana puede ocurrir fácilmente 2, 11, 12. Por lo tanto, el control de la contaminación ambiental puede ayudar en la investigación de brotes y en la evaluación de la eficacia de la limpieza y procedimientos de desinfección.
Varios protocolos de muestreo ambientales se han descrito para la detección de rotavirus, colifago MS2, calicivirus felino (FCV), y bacteriófago P22 13, 14, 15, 16. Sin embargo, las condiciones de validación descritas en estos estudios, incluyendo la desecación rápida (<1 hora) y la escasez de superficie (25 x 100 cm 2), pueden no representar adecuadamente la configuración del campo. Además, el bajos niveles de contaminación de Enviro esperadasuperficies nmental requieren protocolos que son capaces de detectar muy pocas partículas de virus.
Hemos desarrollado un método de muestreo de superficie a base de macroespuma para la detección y tipificación de norovirus. Este método ha sido validado durante varios brotes de norovirus. El protocolo incluye 1) cómo recolectar muestras de frotis de superficies ambientales (2) mejor manera de mantener la integridad de las muestras durante la recogida y el envío al laboratorio, y 3) las pruebas de laboratorio y tipificación de norovirus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los norovirus tienen una dosis infecciosa humana 50% entre 18 y 10 3 20 partículas de virus. Por lo tanto, incluso la contaminación de bajo nivel de las superficies puede suponer un riesgo para la salud pública. Se evaluaron varios aspectos del protocolo de muestreo hisopo incluyendo: 1) diferentes materiales de hisopo, 2) hisopos de condiciones de almacenamiento durante el transporte, 3) la concentración de ARN viral, y 4) colífagos MS2 como el control de la extracción interna. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Generic name for kits | ||||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW | |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 | |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 | |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 | |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 | |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 | |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 | |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | ||
| RNA run-off transcripts | Bacteriophage MS2 (ATCC No. 15597-B1) can be cultivated using Escherichia coli (E.coli) Famp (ATCC No. 700891). | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | GI and GII RNA run off transcripts were quantified spectrophotometrically at A260, diluted in diethyl pyrocarbonate-treated water to 1 × 106 copies/ μl, and stored at −80°C with 1.0 U /μl RNasin (Promega, Madison, WI). | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | ||
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
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