Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces
Summary
A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.
Abstract
noroviruses humanos são uma das principais causas da epidemia e gastroenterite esporádica em todo o mundo. Porque a maioria das infecções são ou transmitida diretamente por via da pessoa-a-pessoa ou indirectamente através de superfícies ambientais ou alimentos, fômites contaminados e superfícies inanimadas são veículos importantes para a propagação do vírus durante surtos de norovírus.
Nós desenvolvido e avaliado um protocolo com cotonetes macro-espuma para a detecção e tipagem de norovírus humanos de superfícies duras. Comparado com cotonetes com ponta de fibra ou toalhetes anti-estáticos, compressas macro-espuma permitir a recuperação de vírus (intervalo 1,2-33,6%) das superfícies de assento de sanita de até 700 cm2. O protocolo inclui passos para a extracção do vírus a partir dos cotonetes e ao aumento da concentração do RNA viral utilizando colunas de centrifugação. No total, 127 (58,5%) das 217 amostras de esfregaço que tinham sido recolhidas a partir de superfícies em navios de cruzeiro e instalações de cuidados de longo prazo, onde norovirus gastroenterite tinham sidorelatado testou positivo para GII norovirus por RT-qPCR. Destes 29 (22,8%) poderia ser genotipados com sucesso. Em conclusão, a detecção de norovírus em superfícies ambientais utilizando o protocolo desenvolvido que pode ajudar a determinar o nível de contaminação do meio ambiente durante surtos, bem como a detecção de vírus quando as amostras não estão disponíveis clínicos; pode também facilitar o acompanhamento da eficácia de estratégias de remediação.
Introduction
Noroviruses humanos são uma das principais causas da epidemia e gastroenterite aguda esporádica em todo o mundo 1, 2, 3. O vírus é extremamente contagiosa ea transmissão ocorre por meio de pessoa direta a interacção pessoa ou indirectamente, através de contacto com os alimentos contaminados, água ou superfícies ambientais. Norovírus pode ser derramado por longos períodos e prolongada sobrevivência do vírus em superfícies ambientais tem sido documentada 1, 2, 3. Durante derramamento de pico, bilhões de partículas de vírus são liberados por grama de fezes e vômito também contém um número suficiente de partículas virais para causar a infecção 4, 5, 6, 7, 8,ef "> 9, 10. Além disso, a transferência do vírus entre as superfícies inanimadas e pele humana pode ocorrer facilmente 2, 11, 12. Por isso, o monitoramento de contaminação ambiental pode ajudar na investigação de surtos e na avaliação da eficácia da limpeza e procedimentos de desinfecção.
Vários protocolos de amostragem ambientais foram descritos para a detecção de rotavírus, colifago MS2, calicivírus felino (FCV), e bacteriófago P22 13, 14, 15, 16. No entanto, as condições de validação descritos nestes estudos, incluindo a dessecação rápida (<1 hora) e da superfície reduzida (25 x 100 cm 2), pode não representar adequadamente as configurações de campo. Além disso, a baixos níveis de contaminação de Enviro esperadosuperfícies nmental requerem protocolos que são capazes de detectar muito poucas partículas de vírus.
Foi desenvolvido um método de amostragem de superfície à base de macro-espuma para a detecção e tipagem de norovírus. Este método foi validado durante vários surtos de norovírus. O protocolo inclui 1) como coletar amostras de esfregaço de superfícies ambientais (2) a melhor forma de manter a integridade das amostras durante a recolha e envio para o laboratório, e 3) testes de laboratório e tipagem de norovirus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os norovírus têm uma dose infecciosa humana 50% entre 18 e 10 3 partículas de vírus 20. Portanto, mesmo a contaminação de baixo nível de superfícies podem representar um risco para a saúde pública. Vários aspectos do protocolo de amostragem swab foram avaliados, incluindo: 1) diferentes materiais de esfregaço, 2) cotonetes condição de armazenamento durante o transporte, 3) concentração de RNA viral, e 4) colifago MS2 como controle de extração interno.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Generic name for kits | ||||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW | |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 | |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 | |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 | |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 | |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 | |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 | |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | ||
| RNA run-off transcripts | Bacteriophage MS2 (ATCC No. 15597-B1) can be cultivated using Escherichia coli (E.coli) Famp (ATCC No. 700891). | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | GI and GII RNA run off transcripts were quantified spectrophotometrically at A260, diluted in diethyl pyrocarbonate-treated water to 1 × 106 copies/ μl, and stored at −80°C with 1.0 U /μl RNasin (Promega, Madison, WI). | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | ||
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
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