QTL Mapping y CRISPR / Cas9 Edición para identificar un gen de resistencia a fármacos en<em> Toxoplasma gondii</em

1. Evaluar SNF r en la progenie de la ME49-FUDR r x VAND-SNF r Cruz NOTA: T. gondii es un parásito intracelular obligado y la fase de taquizoíto crece fácilmente en el cultivo de tejidos. Para cultivar el parásito de T. gondii , mantenerlos en un cultivo de monocapa de Fukroblast de Prepucio Humano confluente (HFF) sembrado en matraces T25 con medio de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (medio D10) a 37 ° C y 5% de CO $ ₂ $. NOTA: Véase Protocolo 1.1 Nota en archivo adicional 1 . Para probar clones de progenie individuales para resistencia a sinefungina, cultivar cada clon a alta densidad de parásitos en un matraz de cultivo T25 HFF durante 2-3 d, hasta que la mayoría de los parásitos comienzan a lisar las células huésped. Raspar la monocapa con un raspador de células y pasar la solución del parásito a través de una jeringa de 10 ml / 22 G aguja romo 2-3x tO lyse las células huésped liberación de parásitos. La solución puede ser arrastrada hacia arriba en la jeringa para múltiples pasajes de aguja. Filtrar la solución del parásito en un nuevo tubo cónico a través de una membrana con el tamaño de poro de 3 μ m para eliminar las células HFF y desechos celulares. Contar los parásitos en un hemocitómetro y determinar el número de parásitos por ml. Usando un pipeteador, pase 2,5 x 10 5 parásitos a un nuevo frasco de cultivo T25 HFF que contenga medio D10 con concentración de trabajo 0,3 μM del fármaco de sinefungina. Cultivar los parásitos a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 7-10 d. Anote la progenie del fenotipo de crecimiento en el fármaco de sinefungina. Observar la monocapa bajo un microscopio de contraste de fase invertido y puntuación 0 para no crecimiento (sensibilidad a la sinefungina), puntuación 1 para el crecimiento y lisis de la monocapa (resistente a la sinefungina). NOTA: Véase el Protocolo 1.8 Nota en el archivo suplementario 1 . 2. RUn a QTL Escaneo del SNF r Fenotipo en R / qtl NOTA: Véase Protocolo 2 Nota en archivo suplementario 1 . Instale el software de lenguaje de programación R en un equipo local. Véase 27 . Ejecute R e instale el paquete 'qtl'. O bien, haga esto desde la opción de interfaz R GUI 'Packages-> Install package (s)' o ejecute el siguiente comando desde la línea de comandos R (el primer símbolo ">" en cada ejemplo denota el inicio de un comando, no debe ser Copiado): > Install.packages ("qtl") NOTA: Una vez que R y el paquete 'qtl' ​​se han instalado, hay dos maneras de ejecutar R / qtl, desde la línea de comandos R o utilizando un programa de interfaz gráfica de usuario (GUI) llamado J / qtl 28 : vea 29 para descargar J / Qtl. Este protocolo proporcionará la sintaxis de línea de comandos R / qtl con referencia ocasional a la función equivalente en J / qtl. Cargue el paquete 'qtl': > Biblioteca (qtl) NOTA: Consulte el Protocolo 2.3 Nota en el archivo suplementario 1 para el formato de dataset y descargas. Cargue el archivo de conjunto de datos en R / qtl. Para el formato "csv" (Ver: Archivo de datos 1): > SNFR <- read.cross (formato = "csv", archivo = "$ PATH / Rqtl-SNFR.csv", genotipos = c ("0", "1"), na.strings = c ("-" , ConvertXdata = FALSE) O para el formato "gary" (Ver: Archivo de datos 2): > SNFR <- read.cross (formato = "gary", dir = "$ PATH", chridfile = "chrid.txt", mnamesfile = "mname.txt", mapfile = "markerpos.txt", genfile = "genotipo. Txt ", phefile =" phenos.txt ", pnamesfile =" fenonames.txt ", convertXdata = FALSE) Donde $ PATH es la ruta del directorio al archivo (s) que contiene el dataset qtl. Por ejemplo: / Users / HotDiggityDog / QTLfiles NOTA: Los archivos también se pueden cargarEd en J / qtl con los comandos anteriores utilizando la opción 'Insertar comentario o comando' o cargar los datos con la opción GUI 'Archivo-> Cargar datos cruzados'. Calcular probabilidades para el mapa: > SNFR <- calc.genoprob (SNFR, paso = 2.0, off.end = 0.0, error.prob = 1.0E-4, map.function = "haldane", stepwidth = "fixed") Ejecutar un único escán utilizando una distribución binaria del fenotipo de resistencia sinefungina en todos los cromosomas: > SNFR.scan <- scanone (cruz = SNFR, chr = c ("Ia", "Ib", "II", "III", "IV", "V", "VI", "VIIa", "VIIb "," VIII "," IX "," X "," XI "," XII "), pheno.col = c (1), modelo =" binario ", method =" em " NOTA: Si ejecuta el fenotipo VIR, utilice la opción de distribución 'model = "normal"'. Ejecutar 1000 permutaciones para calcular umbrales de significación y luego attrIbute las permutaciones a la variable SNFR.scan: > SNFR.scan.permutations <- scanone (cruz = SNFR, chr = c ("Ia", "Ib", "II", "III", "IV", "V", "VI", "VIIa" «VIIb», «VIII», «IX», «X», «XI», «XII»), pheno.col = c (1), modelo = "binario", method = "em", n.perm = 1000, perm.Xsp = FALSE, verbose = FALSE) > Attr (SNFR.scan, "pheno.col") <- c (1) NOTA: Los pasos 2.5 a 2.7 se pueden ejecutar en J / qtl con la opción 'Análisis-> Exploración principal-> Ejecutar un análisis de genoma QTL'. Trace los resultados del análisis: > Plot (SNFR.scan, gap = 0, bandcol = "gray") NOTA: La trama producida en J / qtl es interactiva. Trace los resultados de la exploración para sólo el cromosoma IX, el cromosoma con el pico más alto: > Plot (SNFR.scan, chr = c ("IX"), intervalo = 0, bandcol = "gris", show.marker.names = TRUE) </ol> Mostrar todas las posiciones de marcador y LOD resultados de la exploración única: > SNFR.scan Mostrar los resultados de umbral de la prueba de permutación: > Resumen (SNFR.scan.permutations) Mostrar sólo aquellos marcadores mayores que el valor de umbral alpha = .05 (tomado de la salida anterior): > SNFR.scan [SNFR.scan $ lod> 2,68,] Muestre los marcadores con la puntuación LOD más alta en cada cromosoma: > Resumen (SNFR.scan) Muestre los marcadores que tienen el valor de puntuación LOD máximo (tomado de la salida anterior): > SNFR.scan [SNFR.scan $ lod> = 6.57,] NOTA: Consulte el Protocolo 2.13 Nota en el archivo adicional 1 . 3. Identificar la mutación del SNF r causal usando WGS Lee de la progenie NOTA: Consulte el Protocolo 3 Nota en archivo suplementario 1 . Alinee las lecturas de WGS de la progenie individual a la sensibilidad sinefungina VAND(VAND-SNF s ) genoma parental. NOTA: Descargue el genoma de referencia VAND (SNF) de NCBI Assembly AEYJ00000000.2 y el WGS lee (archivos .sra) para la progenie 24 de NCBI SRA PRJNA258152. Además, descargue los siguientes programas: Bowtie2 11 , NCBI SRA Toolkit, SAMtools 30 , VarScan 12 y MUMmer 31 . Cree un índice compatible con Bowtie 2 del archivo FASTA del genoma de referencia VAND usando el programa bowtie2-build, aquí nombrando el índice "VAND": > Bowtie2-build GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna VAND Convierta los archivos de lectura WGS formateados de SRA a archivos FASTQ usando fastq-dump con la opción –split-files para lecturas emparejadas (el archivo SRR1555372.sra para la progenie P1_14VB se usará como ejemplo): > Fastq-dump –split-files SRR1555372.sra NOTA: Ejecute esto y todos los comandos siguientes en Protocolo 3.1 para todos los 24progenie. Alinee el WGS lee al genoma de referencia usando bowtie2 con salida a un archivo SAM (.sam) y la opción – end-to-end: > Bowtie2 -x VAND -1 SRR155372_1.fastq -2 SRR1555372_2.fastq -S SRR155372.sam – extremo a extremo Convierta el archivo .sam en un archivo BAM (.bam): > Vista de samtools -bS SRR155372.sam> SRR155372.bam Ordenar el archivo .bam: > Samtools clase SRR155372.bam SRR155372.sort Indexar el archivo .bam clasificado: > Índice de samtools SRR155372.sort.bam Llame a SNPs para la progenie usando VarScan NOTA: Véase el Protocolo 3.2 Nota en el archivo suplementario 1 . Convierta todos los archivos BAM (.sort.bam) indexados en un archivo con formato de pileup utilizando samtools mpileup con el archivo de referencia del genoma VAND, todos los archivos .sort.bam de progenie y salida a un archivo llamado AllProgeny-mpileup.txt: > Samtools mpileup -f GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna SRR1555599.Sort.bam SRR1555372.sort.bam SRR1555660.sort.bam SRR1555672.sort.bam SRR1556052.sort.bam SRR1556122.sort.bam SRR1556192.sort.bam SRR1556194.sort.bam SRR1556195.sort.bam SRR1556199.sort.bam SRR1556200. Sort.bam SRR1556202.sort.bam SRR1556203.sort.bam SRR1556274.sort.bam SRR1556276.sort.bam SRR1556278.sort.bam SRR1556395.sort.bam SRR1556396.sort.bam SRR1556397.sort.bam SRR1556398.sort.bam SRR1556399. Sort.bam SRR1556400.sort.bam SRR1556401.sort.bam SRR1556402.sort.bam> AllProgeny-mpileup.txt Llamar a todos los SNPs utilizando el programa VarScan mpileup2snp usando el archivo AllProgeny-mpileup.txt, la cobertura mínima de lectura de 5, la frecuencia mínima de la variante a través de lecturas de .8, un valor p de .01 y la salida a un nombre de archivo AllProgeny-SNPs. TXT: > Java -jar VarScan.jar mpileup2snp AllProgeny-mpileup.txt –min-cobertura 5 –min-var-freq .8 –p-valor .01> AllProgeny-SNPs.txt NOTA: El archivo AllProgeny-SNPs.txt es un archivo de texto delimitado por tabuladores que se utilizará en el Protocolo 3.4 para localizarEl SNP causal. Buscar VAND genoma coordenadas que corresponden a las coordenadas de la ME49 basado QTL locus NOTA: Véase el Protocolo 3.3 Nota en el archivo suplementario 1 . Utilice el programa MUMmer nucmer para alinear el genoma ME49 (disponible para descargar desde ToxoDB.org 32 ) y el archivo de genoma de referencia VAND (la salida va al archivo out.delta): > Nucmer ToxoDB-28_TgondiiME49_Genome.fasta GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna Utilice el programa MOMER show-coords para obtener las coordenadas de las dos alineaciones del genoma, la salida a un archivo llamado ME49vsVAND-coords.txt: > Show-coords out.delta> ME49vsVAND-coords.txt NOTA: El archivo ME49vsVAND-coords.txt se puede usar para encontrar los contigs VAND y las posiciones que corresponden al locus QTL; Marcadores MV359 a MV366 localizado en el cromosoma IX de ME49 entre 3,187,537 a 4,202,258 pb. Hay dos contigs VAND que cubren el correspLocalización QTL; KN044604.1: 657.441-1 pb y KN042501.1: 430.910-41.870 pb (ambos contigs se alinean inversamente con el cromosoma ME49). Evalúe los SNPs de progenie localizados dentro del locus QTL para SNP heredados sólo en la progenie SNF r NOTA: Consulte el Protocolo 3.4 Nota en el archivo suplementario 1 . Revise el archivo de datos 3 para identificar la mutación causal localizada dentro del locus QTL. Escanee los datos para un patrón en el que la progenie SNF r tenga un SNP y los SNF no lo sean (posible porque los SNPs de la progenie fueron obtenidos por comparación con el genoma de referencia de VAND-SNF). Esto sólo debería resultar en una posición con este patrón, la posición 348130 en VAND contig KN042501.1. Vea la fila 6604 en el archivo de datos 3 ( Figura 3 ). NOTA: Consulte el Protocolo 3.4.2 Nota en el archivo suplementario 1 . 4. Verificación de Hits Identificados por CRISPR / Cas9-La inactivación génica mediada. NOTA: Para confirmar el SNP causal identificado por el mapeo de QTL y el análisis de WGS SNP, los cambios genéticos correspondientes deben realizarse en un fondo de WT SNF y el fenotipo resultante examinado. En el caso de resistencia a la sinefungina, la mutación responsable resulta en la inactivación del gen SNR1 por terminación temprana [ 2] . Por lo tanto, la interrupción de SNR1 se puede utilizar para la confirmación. Aquí un protocolo detallado se proporciona para el uso de CRISPR / Cas9 indu indu mutaciones para interrumpir SNR1 , para demostrar su participación en la resistencia sinefungina ( Figura 4 ]. Construcción específica de plásmidos CRISPR de SNR1 NOTA: Véase el Protocolo 4.1 Nota en el Archivo Suplementario 1 para obtener plásmidos y mapas. Obtener la secuencia genómica para el gen diana ( SNR1 , TGME49_290860) de ToxoDB 32 . Use herramientas en línea como E-CRISP 33 para diseñar gRNAs específicos de destino. No incluya la secuencia de PAM (NGG) en el gRNA. NOTA: Consulte el Protocolo 4.1.2 Nota en el archivo suplementario 1 . Sintetizar los cebadores para construir el plásmido CRISPR específico para el objetivo. De acuerdo con el diseño de la etapa 4.1.2, sintetizar dos cebadores para cambiar el UPRT que apunta al gRNA en el plásmido CRISPR original a la secuencia de gRNA seleccionada por mutagénesis dirigida al sitio. NOTA: Las secuencias de estos dos cebadores son las siguientes: gRNA – Fw: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC (N20 es la secuencia de gRNA específica para diana) y gRNA – Rv: AACTTGACATCCCCATTTAC 2 . Realizar las reacciones de mutagénesis dirigida al sitio. Usando la UPRT dirigida al plásmido CRISPR (pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRT) como plantilla y los dos cebadores listados anteriormente, realizan reacciones de mutagénesis dirigida al sitioDe acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: Utilice las siguientes condiciones de ciclo para PCR: 98 ° C durante 1 min, seguido de 25 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 5 min, seguido de extensión final durante 2 min A 72 ° C. Transformar los productos de mutagénesis que contienen los plásmidos CRISPR específicos de GOI a células competentes de E. coli mediante transformación química de acuerdo con el protocolo del proveedor (ver Tablas de Materiales ). Se cultivan los transformantes en placas de caldo de lisogénesis (LB) que contienen ampicilina (100 mu g / ml) a 37ºC. Posteriormente, recoger 2-4 clones y cultivarlos individualmente en 5 ml de medio LB suplementado con 100 μg / ml de ampicilina durante 12-16 h. Extraer los plásmidos de los cultivos utilizando un kit de aislamiento de ADN y analizarlos mediante electroforesis en gel de ADN para comprobar el tamaño de los plásmidos (el tamaño esperado del plásmido es 9674 pb, usar el plásmido CRISPR original como cOntrol). Utilizar el cebador M13-Rev (5'-CAGGAAACAGCTATGACC) para secuenciar los plásmidos para confirmar la secuencia específica de gRNA específico. Una vez que se identifican los clones positivos, almacenar el ADN del plásmido a -20 ° C y el cultivo bacteriano correspondiente a -80 ° C para uso futuro. NOTA: El plásmido CRISPR que se va a utilizar para la transfección debe disolverse en agua desionizada y la concentración se determinará mediante espectrofotometría o un método alternativo. Transfección de parásitos. NOTA: Los métodos generales para cultivar T. gondii en células HFF en medio D10 se han descrito previamente 34 . Dos o tres días antes de la transfección, a~nadir suficientes parásitos a un matraz T25 que contiene una monocapa de células HFF confluentes (0,5-1 x 10 6 para cepas de tipo 1, 1-2 x 10 6 para otras cepas) para conseguir una célula HFF de 70-80% Lisis dentro de 2-3 d. ExamenEl cultivo bajo un microscopio de contraste de fase invertida, cuando la monocapa HFF es 70-80% lisada por los parásitos. Elimine suavemente el medio con una pipeta y lave las células de la superficie del matraz con 5 ml de tampón citomix (KCl 120 mM, CaCl2 0,15 mM, K2HPO4 10 mM / KH2PO4 pH = 7,6, HEPES 25 mM, MM de EDTA, 5 mM de MgCl $ ₂ $, pH = 7,6). Posteriormente, transfiera la solución del parásito a un tubo cónico de 15 ml. NOTA: Véase Protocolo 4.2.2 Nota en el archivo suplementario 1 . Pasar la solución del parásito a través de una jeringa de 10 ml / 22 G aguja romo 2-3x. Filtrar la solución del parásito en un nuevo tubo cónico a través de una membrana con el tamaño de poro de 3 μ m para eliminar las células HFF y desechos celulares. Pellet los parásitos filtrados por centrifugación a 400 xg durante 10 min. Se desprende el sobrenadante y se resuspenden los parásitos granulados con 10 ml de tampón citomix, se toma una alícuota de 10 μl a detArminar la concentración del parásito con un hemocitómetro y sedimentar el resto por centrifugación a 400 × g durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en tampón citomix para obtener una densidad de 4 x 10 7 parásitos / mL. En una cubeta de separación de 4 mm, mezcle 250-300 μL de solución parasitaria (1-1,3 x 10 7 parásitos) con 7,5 μg de plásmido CRISPR, 6 μl de ATP (100 mM) y 6 μL de glutatión (GSH) (250 mM). Electroporación de los parásitos 35 . Incluyen una electroporación separada como un control negativo en el que un plásmido CRISPR se dirige a otros lugares, tales como el plásmido CRIPSR dirigido a UPRT. NOTA: Los ajustes de electroporación dependen del dispositivo. Para el electroporador listado en los Materiales utilice las cubetas de separación de 4 mm. Se recomienda el siguiente protocolo: 1.700 V, 176 μs de longitud de impulso, 2 pulsos con intervalo de 100 ms. Determinar la frecuencia de sinefungin resistaNce después de la orientación de CRISPR. Sembrar las células HFF a los cubreobjetos colocados en placas de 24 pocillos 3-4 d antes de la electroporación para que sean confluentes en el tiempo para realizar la transfección en 4.2. Se tripsinizan las células HFF de un matraz T25 confluente y posteriormente se añaden 12 ml de medio D10 y se mezclan bien. Añadir una cubreobjetos a cada pocillo de una placa de 24 pocillos y colocar alícuota de 500 μl de solución de células HFF en cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C durante 3 4 d para dejar que las células crecen hasta confluentes. NOTA: Las células de un matraz T25 son suficientes para sembrar una placa de 24 pocillos. Añadir 50 μl de solución de parásito electroporado de la etapa 4.2.9 en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga una cubreobjetos sembrados con células HFF confluentes. Transferir el resto de la solución de parásito electroporado en un matraz T25 sembrado con células HFF confluentes. Evaluar la eficiencia de la transfección. Cultivar las células en la placa de 24 pocillos durante 24 hY posteriormente fijar las células (células huésped y parásitos) con 500 μl de formaldehído al 4% para comprobar la expresión de Cas9-GFP por ensayo inmunofluorescente (IFA). Pruebe las células con un anticuerpo anti-GFP y un anticuerpo específico Toxoplasma (como anti-TgALD) para etiquetar los parásitos totales. Consulte la hoja de productos de anticuerpos para la dilución recomendada (por lo general, 1: 1.000 es suficiente para los IFA). Si los anticuerpos no están conjugados, utilice dos anticuerpos secundarios diferentes conjugados con colorantes fluorescentes para marcar los anticuerpos primarios. Observe las células etiquetadas en un microscopio fluorescente con filtros apropiados para los colorantes fluorescentes secundarios. Obtener la eficacia de transfección dividiendo el número de parásitos positivos de GFP por el número de parásitos totales. NOTA: Los dos anticuerpos utilizados para IFA deben provenir de dos especies diferentes de huésped, por ejemplo usando la combinación de anti-GFP de ratón y anti-TgALD de conejo. Determine el fDe resistencia a la sinefungina en parásitos transfectados. Para los parásitos transfectados cultivados en frascos T25, cultivarlos durante 2-3 d hasta la salida natural. A continuación, recoger los parásitos, romper aguja lyse células huésped para liberar parásitos intracelulares, y purificar por filtración a través de membranas con un tamaño de poro de 3 μ m. Contar los parásitos con un hemocitómetro para estimar la densidad. Agregar parásitos purificados en placas de 6 pocillos sembradas con células HFF confluentes: para la primera fila (3 pocillos), añadir 200 parásitos / pocillo y cultivarlos en medio D10 regular (2 ml / pocillo); Para la segunda fila, añadir 5000 parásitos / pozo y cultivarlos en medio D10 que contiene 0,3 μ M sinefungina. Poner las placas en una incubadora de CO 2 al 5% y cultivar los parásitos a 37 ° C 8-10 d sin perturbación para permitir que se formen placas. Se fijan las muestras con etanol al 70% (2 ml / pocillo) y se tiñe la monocapa con violeta de cristal al 0,1% (2 ml / pocillo). Lavar los pocillos con agua para visualizarLas placas (zonas claras) formadas por el crecimiento del parásito. NOTA: El control negativo debe ser procesado de la misma manera lado a lado. Calcular la tasa de resistencia a la sinefungina inducida por CRISPR. Obtener el número promedio (X) de placas de los pozos que no contienen fármaco y calcular la viabilidad del parásito como X / 200. Obtenga el número promedio (Y) de placas de pozos que contienen sinefungina para calcular la tasa de resistencia a sinefungina inducida por CRISPR como sigue: Tasa de resistencia inducida por CRISPR = 200 × Y / (5000 × X × eficiencia de transfección) NOTA: La eficiencia de transfección se obtiene de 4.3.2. Examinar las mutaciones indel inducidas por CRISPR / Cas9 Cultivar los parásitos electroporados de la sección 4.2.9 en un matraz T25 sembrado con células HFF durante 2 d a 37 ° C. A continuación, se sustituye el medio por 5 ml de medio D10 que contiene 0,3 μM de sinefungina (medio de selección). Mantener los parásitos en el medio de selección durante al menos 3 pasadas hasta que el grupo resistente se estabilice (indicado por la ausencia de crecimiento del parásito en el grupo de control negativo pero crecimiento robusto del parásito en el grupo experimental). Subclonar el grupo de resistencia a sinefungina para obtener cepas clonales. Recolectar parásitos recién egresados, purificar mediante filtración de membrana de 3 μm y subclonar en placas de 96 pocillos sembradas con células HFF confluentes en 150 μl de medio D10. Cultivar los cultivos de subclonación en un incubador de CO 2 a 37 ° C durante 7 – 10 d sin alterar las placas. NOTA: Véase el Protocolo 4.4.2.1 Nota en el Archivo complementario 1 . Compruebe las placas de 96 pocillos bajo un microscopio de contraste de fase invertido para buscar pozos que contengan sólo una placa. Marcar tales pozos y posteriormente transferir las células de cada pocillo a placas de 24 pocillos sembradas con células HFF usando una pipeta. <Cuando 80-90% de las células HFF en un pozo se lisan, recolecta los parásitos (aproximadamente 500 μL) y pasa 50 μL de solución parásita a un nuevo pozo para mantener la cepa. Utilice el resto (≈450 μl) para extraer el ADN genómico para la amplificación por PCR. Para el aislamiento del ADN genómico del clon de SNF r , pellet los parásitos (pequeñas cantidades de contaminación de células HFF es tolerable) a 1.000 xg durante 10 min. Lave los parásitos granulados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) una vez y pételos de nuevo. Aísle el ADN genómico de las células sedimentadas usando un kit comercial o por ebullición. Resuspender los parásitos en 50-100 μ l de PBS. NOTA: Realizar PCR para obtener un fragmento del gen SNR1 para la secuenciación. Utilizar los siguientes cebadores para amplificar el locus SNR1 2 : SNR1-Amp-Fw: 5 'CCGACCACAA CAATTTTC y SNR1-Amp-Rv: 5'GACGTGATTCACTTTTTTACAGACAGAC. Utilice ADN polimerasas de alta fidelidad. Amplificar el locus WT para fines de control. EjecutarPCR con 20 mu l de volumen de reacción y se lleva a cabo con el siguiente programa: 98ºC durante 1 min, seguido de 30 ciclos de 98ºC durante 10 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 2,5 min, seguido por Extensión final durante 2 min a 72 ° C. NOTA: Secuencia de los productos de PCR usando los siguientes cebadores: SNR1-Seq1: 5 'GCC ACA TGC TTT AGC GTG, SNR1-Seq2: 5' TCC TCT CCA TCA CGG GTT GG, SNR1-Seq3: 5 'GCA AGA GCC GCG TGA CG , SNR1-Seq4: 5 'CTC TCC CGC GGT CGA G, SNR1-Seq5: 5' GCA CCG TCC GCA AGC y SNR1-Seq6: 5 'CCG GAA GGT GAA TCG TTC TTC. Comparar las secuencias del gen SNR1 de mutantes resistentes a sinefungina a la de la cepa WT utilizando una herramienta de alineación de secuencias. NOTA: Véase el Protocolo Adicional 2 Protocolo 5 para detalles sobre la utilización de la selección negativa en el locus SNR1 para la complementación genética o la construcción de la cepa transgénica.