QTLマッピングとCRISPR / Cas9編集による薬剤耐性遺伝子同定<em> Toxoplasma gondii</em

1.ME49-FUDR r x VAND-SNF r Crossの子孫におけるSNF rを評価する注： T.ゴンディイは偏性細胞内寄生虫であり、タキゾイト期は組織培養で容易に生育する。 T. gondii寄生虫を成長させるために、37℃で10％ウシ胎仔血清（FBS）（D10培地）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）培地でT25フラスコに播種したコンフルエントなヒト包皮線維芽細胞（HFF） Cおよび5％CO 2を含む 。 注記： 補足ファイル1のプロトコル1.1注を参照してください。 シネフンギン耐性のために個々の子孫クローンを試験するために、寄生虫の大部分が宿主細胞を溶解し始めるまで、T25 HFF培養フラスコ中で各クローンを高寄生虫密度まで2〜3日間増殖させる。 単層を細胞スクレーパーでかき集め、寄生虫溶液を10mLシリンジ/ 22Gの鈍い針に2〜3回通す。寄生虫を放出する宿主細胞を溶解する。溶液は、複数の針通路のために注射器に引き戻すことができる。 HFF細胞および細胞破片を除去するために、3μmの孔サイズを有する膜を通して、新しい円錐管に寄生虫溶液を濾過する。 血球計数器で寄生虫を数え、1mLあたりの寄生虫の数を決定する。 ピペッターを用いて、0.3μMの作用濃度のsinefungin薬物を含むD10培地を含む新しいT25 HFF培養フラスコに2.5×10 5個の寄生虫を通す。 寄生虫を7〜10日間37℃、5％CO 2で生育させます。 シネフンギン薬の成長表現型の子孫をスコアリングする。単層を倒立位相差顕微鏡下で観察し、無成長（sinefungin感受性）についてスコア0、単層（sinefungin耐性）の成長および溶解についてスコア1。 注： 補足ファイル1のプロトコル1.8の注を参照してください。 2. RR / qtlにおけるSNF r表現型のQTLスキャン注記： 補足ファイル1のプロトコル2の注を参照してください。 Rプログラミング言語ソフトウェアをローカルコンピューターにインストールします。 27を参照してください。 Rを実行し、パッケージ 'qtl'​​をインストールします。これは、R GUIインターフェースのオプション 'Packages-> Install package'から実行するか、またはRコマンド行から次のコマンドを実行してください（各例の最初の「>」記号は、コピー）： > install.packages（ "qtl"） 注：Rとqtlパッケージがインストールされたら、Rコマンドラインから、またはJ / qtl 28というグラフィカルユーザーインターフェイス（GUI）プログラムを使用して、R / qtlを実行する2つの方法があります。 / qtl。このプロトコルは、R / qtlコマンドライン構文を提供し、J / qtlの同等の機能を時折参照します。 'qtl'​​パッケージを読み込みます： >ライブラリー（qtl） 注記：データセット形式とダウンロードについては、 補足ファイル1のプロトコル2.3を参照してください。 R / qtlにデータセットファイルをロードします。 "csv"形式（データファイル1を参照）： （ "0"、 "1"）、na.strings = c（ " – "）> SNFR < – read.cross（format = "csv"、file = "$ PATH / Rqtl-SNFR.csv"、genotypes = c 、convertXdata = FALSE） または "ゲーリー"形式（参照：データファイル2）： > SNFR < – read.cross（format = "gary"、dir = "$ PATH"、chridfile = "chrid.txt"、mnamesfile = "mname.txt"、mapfile = "markerpos.txt"、genfile = "genotype。 txt "、phefile =" phenos.txt "、pnamesfile =" phenonames.txt "、convertXdata = FALSE） $ PATHは、qtlデータセットを含むファイルへのディレクトリパスです。例：/ Users / HotDiggityDog / QTLfiles 注：ファイルを読み込むこともできます'Insert Comment or Command'オプションを使用して以前のコマンドでJ / qtlに編集したり、GUIの 'File-> Load Cross Data'オプションでデータをロードします。 マップの確率を計算する： > SNFR < – calc.genoprob（SNFR、ステップ= 2.0、off.end = 0.0、error.prob = 1.0E-4、map.function = "haldane"、stepwidth = "fixed"） すべての染色体にわたってsinefungin耐性表現型のバイナリ分布を使用して1回のスキャンを実行する： > SNFR.scan < – scanone（cross = SNFR、chr = c（ "Ia"、 "Ib"、 "II"、 "III"、 "IV"、 "V"、 "VIIa"、 "VIIb" "、" XI "、" XII "）、pheno.col = c（1）、model =" binary "、method =" em "） 注：VIR表現型を実行する場合、 'model = "normal"'配布オプションを使用してください。 有意差の閾値を計算するために1000の順列を実行し、次にattr順列をSNFR.scan変数にibuteします。 > SNFR.scan.permutations < – scanone（cross = SNFR、chr = c（ "Ia"、 "Ib"、 "II"、 "III"、 "IV"、 "V"、 "VI"、 "VIIa" 、 "model" = "binary"、method = "em"、n.perm = "1"、 " 1000、perm.Xsp = FALSE、詳細= FALSE） > attr（SNFR.scan、 "pheno.col"）< – c（1） 注：手順2.5から2.7は、「分析 – >メインスキャン – > 1つのQTLゲノムスキャンを実行する」オプションを使用してJ / qtlで実行できます。 スキャン結果をプロットする： >プロット（SNFR.scan、gap = 0、bandcol = "gray"） 注記：J / qtlで作成されたプロットはインタラクティブです。 最高のピークを有する染色体IXのスキャン結果をプロットする： > plot（SNFR.scan、chr = c（ "IX"）、gap = 0、bandcol = "gray"、show.marker.names = TRUE） </ol> 1回のスキャンでマーカーの位置とLODのスコアをすべて表示： > SNFR.scan 順列テストのしきい値結果を表示する： >要約（SNFR.scan.permutations） アルファ= .05のしきい値（以前の出力から取得）よりも大きいマーカのみを表示する： > SNFR.scan [SNFR.scan $ lod> 2.68、] 各染色体上で最高のLODスコアを持つマーカーを表示する： >要約（SNFR.scan） LODスコアの最大値を持つマーカーを表示する（前の出力から取得）： > SNFR.scan [SNFR.scan $ lod> = 6.57、] 注記： 補足ファイル1のプロトコル2.13注を参照。 3.子孫からのWGS読取りを用いた原因SNF r突然変異の同定注記： 補足ファイル1のプロトコル3の注を参照してください。 個々の子孫のWGS読み取りをsinefunginに敏感なVANDに合わせる（VAND-SNF s ）の親ゲノム。 注：NCBI Assembly AEYJ00000000.2からVANDリファレンスゲノム（SNF s ）をダウンロードし、NCBI SRA PRJNA258152から24子孫のWGS読み込み（.sraファイル）。また、Bowtie2 11 、NCBI SRA Toolkit、SAMtools 30 、VarScan 12 、MUMmer 31のプログラムをダウンロードしてください。 bowtie2-buildプログラムを使用して、VANDリファレンスゲノムFASTAファイルからBowtie 2互換インデックスを作成します。ここでは、 "VAND"というインデックスが付けられています。 > bowtie2-build GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna VAND fasts-dumpを使用してSRA形式のWGS読み込みファイルをFASTQファイルに変換します。ペアリングされた読み込みには–split-filesオプションを使用します（例：P1J4VBのSRR1555372.sraファイルが例として使用されます）。 > fastq-dump –split-files SRR1555372.sra 注：これを実行し、すべての24のプロトコル3.1の次のすべてのコマンド子孫。 bowtie2を使用してWGS読み取りを参照ゲノムに整列させ、SAM（.sam）ファイルと–end-to-endオプションへの出力を行います。 > bowtie2 -x VAND-1 SRR155372_1.fastq -2 SRR1555372_2.fastq -S SRR155372.sam –end-to-end .samファイルをBAM（.bam）ファイルに変換します。 > samtoolsの表示-bS SRR155372.sam> SRR155372.bam .bamファイルをソートする： > samtools sort SRR155372.bam SRR155372.sort ソートされた.bamファイルのインデックスを作成する： > samtoolsインデックスSRR155372.sort.bam VarScanを使用して子孫のSNPを呼び出す 注記： 補足ファイル1のプロトコル3.2注を参照してください。 VANDゲノム参照ファイル、すべての子孫.sort.bamファイルを含むsamtools mpileupを使用して、すべての索引付きBAM（.sort.bam）ファイルを1つのファイル形式のファイルに変換し、AllProgeny-mpileup.txtという名前のファイルに出力します。 > samtools mpileup -f GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna SRR1555599。ソート.bam SRR1555372.sort.bam SRR1555660.sort.bam SRR1555672.sort.bam SRR1556052.sort.bam SRR1556122.sort.bam SRR1556192.sort.bam SRR1556194.sort.bam SRR1556195.sort.bam SRR1556199.sort.bam SRR1556200。ソート.bam SRR1556202.sort.bam SRR1556203.sort.bam SRR1556274.sort.bam SRR1556276.sort.bam SRR1556278.sort.bam SRR1556395.sort.bam SRR1556396.sort.bam SRR1556397.sort.bam SRR1556398.sort.bam SRR1556399。 sort.bam SRR1556400.sort.bam SRR1556401.sort.bam SRR1556402.sort.bam> AllProgeny-mpileup.txt AllProgeny-mpileup.txtファイルを使用してVarScan mpileup2snpプログラムを使用してすべてのSNPを呼び出す。最小読み取りカバレッジは5、最小読み取り頻度は.8、最小P値は.01、ファイル名AllProgeny-SNPに出力する。 TXT： > java -jar VarScan.jar mpileup2snp AllProgeny-mpileup.txt –min-coverage 5 – min-var-freq .8 –p値.01> AllProgeny-SNPs.txt 注：AllProgeny-SNPs.txtファイルは、プロトコル3.4で使用されるタブで区切られたテキストファイルです原因のSNP。 ME49に基づくQTL遺伝子座の座標に対応するVANDゲノム座標を見つける 注記： 補足ファイル1のプロトコル3.3の注を参照してください。 MUMmer nucmerプログラムを使用してME49ゲノム（ToxoDB.org 32からダウンロード可能）とVAND参照ゲノムファイルを整列させます（出力はout.deltaファイルに送られます）。 > nucmer ToxoDB-28_TgondiiME49_Genome.fasta GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna MUMmer show-coordsプログラムを使用して、ME49vsVAND-coords.txtという名前のファイルに出力された2つのゲノムアライメントの座標を取得します。 > show-coords out.delta> ME49vsVAND-coords.txt 注：ME49vsVAND-coords.txtファイルを使用して、QTL遺伝子座に対応するVANDコンティグおよび位置を見つけることができます。 ME49染色体IX上に位置するMV359〜MV366のマーカーは、3,187,537〜4,202,258bpである。 correspondingpにまたがる2つのVANDコンティグがありますQTL遺伝子座上に存在する。 KN044604.1：657,441-1 bpおよびKN042501.1：430,910-41,870 bp（両方のコンティグはME49染色体と逆に整列する）。 SNF r子孫でのみ継承されたSNPについてQTL遺伝子座内に位置する子孫SNPを評価する 注記： 補足ファイル1のプロトコル3.4の注を参照。 データファイル3をレビューして、QTL遺伝子座内に位置する因果的突然変異を同定する。 SNF r子孫がSNPを有し、SNF が存在しないパターン（子孫SNPがVAND-SNF の参照ゲノムとの比較によって得られたものであるため）がデータをスキャンする。これは、VAND contig KN042501.1上の348130位のこのパターンで1つの位置にのみ生じるはずです。 データファイル3の行6604を参照してください（ 図3 ）。 注記： 補足ファイル1のプロトコル3.4.2を参照してください。 4. CRISPR / Cas9による同定されたヒットの検証 -遺伝子仲介による遺伝子不活性化。 注：QTLマッピングおよびWGS SNP分析によって同定された因果的SNPを確認するためには、対応する遺伝的変化をWT SNF のバックグラウンドで行い、結果として生じる表現型を調べる必要があります。シネファンギン耐性の場合、責任ある突然変異は、早期終了2によりSNR1遺伝子の不活性化をもたらす。したがって、確認のためにSNR1を中断することができます 。ここでは、CRISP / Cas9誘導indel変異を用いてSNR1を破壊し、sinefungin耐性に関与することを証明するための詳細なプロトコールを提供する（ 図4 ）。 SNR1特異的CRISPRプラスミド構築 注：プラスミドおよび地図を得るためには、 補遺ファイル1のプロトコル4.1の注を参照のこと。 ToxoDB 32から標的遺伝子（ SNR1 、TGME49_290860）のゲノム配列を取得する。 E-CRISP 33などのオンラインツールを使用して、標的特異的gRNAを設計する。 gRNAにPAM配列（NGG）を含めないでください。 注記： 補足ファイル1のプロトコル4.1.2を参照してください。 標的特異的CRISPRプラスミドを構築するためにプライマーを合成する。 ステップ4.1.2の設計によれば、2つのプライマーを合成して、元のCRISPRプラスミドのUPRTターゲティングgRNAを、部位特異的突然変異誘発によって選択されたgRNA配列に変化させる。 注：これらの2つのプライマーの配列は、gRNA-Fw：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTAGAGCTAGAAATAGC（N20は標的特異的gRNA配列）およびgRNA-Rv：AACTTGACATCCCCATTTAC2である。 部位特異的突然変異誘発反応を行う。 テンプレートとしてCRISPRを標的とするUPRTプラスミド（pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRT）および上記の2つのプライマーを使用して、部位特異的突然変異誘発反応製造元の説明書に従って。 注：PCRには以下のサイクリング条件を使用してください：98℃で1分間、次に98℃で10秒間、55℃で30秒間および72℃で5分間のサイクルを25サイクル、その後2分間の最終伸長72℃で保存した。 GOI特異的CRISPRプラスミドを含む突然変異誘発産物を、供給者のプロトコル（ 表の表を参照）に従って化学的形質転換により大腸菌コンピテント細胞に形質転換する。 37℃でアンピシリン（100μg/ mL）を含む溶菌液（LB）プレート上で形質転換体を増殖させる。続いて、2-4クローンを選択し、100μg/ mLアンピシリンを補充した5mL LB培地中で12〜16時間、それらを個々に増殖させる。 DNA単離キットを使用して培養物からプラスミドを抽出し、DNAゲル電気泳動によりそれらを分析してプラスミドのサイズを確認する（予想されるプラスミドサイズは9674bpであり、オリジナルのCRISPRプラスミドをcオン）。 M13-Revプライマー（5'-CAGGAAACAGCTATGACC）を用いてプラスミドを配列決定し、標的特異的gRNA配列を確認する。 陽性クローンが同定されたら、プラスミドDNAを-20℃で保存し、対応する細菌培養物を-80℃で保存してください。 注：トランスフェクションに使用するCRISPRプラスミドは、脱イオン水に溶解し、濃度は分光光度法または別の方法で測定する必要があります。 寄生虫トランスフェクション。 注：D10培地中のHFF細胞においてT.ゴンディイを培養する一般的な方法は、以前に記載されている34 。 トランスフェクションの2〜3日前に、70〜80％のHFF細胞を達成するために、コンフルエントHFF細胞単層（1型株については0.5〜1×10 6 、他の株については1〜2×10 6 ）を含むT25フラスコに十分な寄生虫を加える2〜3日以内に溶解する。 ExamiHFF単層が寄生虫によって70〜80％溶解されるとき、逆位相差顕微鏡下で培養物を培養する。ピペットで培地を静かに除去し、細胞を5mLのcytomix緩衝液（120mM KCl、0.15mM CaCl 2、10mM K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 pH = 7.6,25mM HEPES、2 mM EDTA、5mM MgCl 2 、pH = 7.6）で洗浄した。続いて、寄生虫溶液を15mLコニカルチューブに移す。 注記： 補足ファイル1のプロトコル4.2.2を参照してください。 寄生虫溶液を10mLシリンジ/ 22G鈍い針に2〜3回通す。 HFF細胞および細胞破片を除去するために、3μmの孔サイズを有する膜を通して、新しい円錐管に寄生虫溶液を濾過する。 濾過した寄生虫を400xgで10分間遠心分離してペレット化する。 上清を取り除き、10mLのcytomix緩衝液で沈殿した寄生虫を再懸濁し、10μLのアリコートをdetヘモサイトメーターで寄生虫の濃度を決定し、400×gで10分間遠心分離して残りのペレットをペレット化する。 上清を除去し、4×10 7寄生虫/ mLの密度を得るために、細胞ミックス緩衝液中でペレットを再懸濁する。 4 mmギャップのキュベットに、7.5μgのCRISPRプラスミド、6μLのATP（100 mM）、6μLのグルタチオン（GSH）（250 mM）を含む250-300μLの寄生虫溶液（1-1.3×107個の寄生虫）を混合する。 寄生虫を電気穿孔する35 。 CRISPプラスミドを標的とするUPRTなどの他の場所をCRISPRプラスミドが標的とする陰性対照として、別のエレクトロポレーションを含める。 注：エレクトロポレーションの設定はデバイスによって異なります。材料に記載されているエレクトロポレーターについては、4 mmギャップキュベットを使用します。次のプロトコルを推奨します：1,700 V、パルス長176μs、100 ms間隔で2パルス。 正弦波抵抗の周波数を決定するCRISPRターゲティング後にnce。 HFF細胞をエレクトロポレーションの前に24ウェルプレートに3〜4日間置いたカバーガラスに接種し、4.2でトランスフェクションを行う時間までにコンフルエントになるようにする。 1つのコンフルエントなT25フラスコからHFF細胞をトリプシン処理し、続いて12mLのD10培地を添加し、よく混合する。 24ウェルプレートの各ウェルにカバースリップを加え、各ウェルに500μLのHFF細胞溶液を分注する。細胞をコンフルエントになるまで増殖させるために、プレートを37℃で3〜4日間インキュベートする。 注：1つのT25フラスコからの細胞は、1つの24ウェルプレートを播種するのに十分です。 コンフルエントHFF細胞を播種したカバースリップを含む24ウェルプレートの1つのウェルに、ステップ4.2.9からエレクトロポレーションした寄生虫溶液50μLを添加する。コンフルエントHFF細胞を播種したT25フラスコにエレクトロポレーションした寄生虫溶液の残りを移す。 トランスフェクションの効率を評価する。 24ウェルプレート中で24時間培養する。その後、細胞（宿主細胞および寄生虫）を500μlの4％ホルムアルデヒドで固定して、免疫蛍光アッセイ（IFA）によるCas9-GFPの発現を調べた。 細胞を、抗GFP抗体およびトキソプラズマ特異的抗体（例えば、抗TgALD）でプローブして、全寄生虫を標識する。推奨希釈液については、抗体製品シートを参照してください（通常、IFAの場合は1：1,000で十分です）。抗体がコンジュゲートしていない場合は、一次抗体を標識するために蛍光色素と結合した2つの異なる二次抗体を使用する。 二次蛍光色素に適したフィルターを用いて蛍光顕微鏡で標識細胞を観察する。 GFP陽性寄生虫の数を全寄生虫の数で割ることにより、トランスフェクション効率を得る。 注：IFAに使用される2つの抗体は、例えば、マウス抗GFPとウサギ抗TgALDとの組み合わせを用いて、2つの異なる宿主種に由来するはずである。 fを決定するトランスフェクトされた寄生虫におけるシネフンギン耐性の必要性。 T25フラスコで培養されたトランスフェクトされた寄生虫については、天然の出芽まで2〜3日間成長させる。その後、寄生虫を収集し、鈍いニシン溶菌宿主細胞を細胞内寄生虫を放出させ、そしてそれらを3μmの孔サイズを有する膜を通す濾過によって精製する。密度を推定するために、血球計数器で寄生虫を数える。 コンフルエントなHFF細胞を播種した6穴プレートに精製寄生虫を加える：最初の列（3ウェル）に200の寄生虫/ウェルを加え、それらを通常のD10培地（2mL /ウェル）で増殖させる。 2列目には5000個の寄生虫を加え、0.3μMのシネフンギンを含むD10培地で増殖させます。 プレートを5％CO 2インキュベーターに入れ、37℃で8〜10日間、寄生虫を成長させ、プラークを形成させる。サンプルを70％エタノール（2mL /ウェル）で固定し、0.1％クリスタルバイオレット（2mL /ウェル）で単層を染色する。水で井戸を洗って可視化する寄生虫の成長によって形成されたプラーク（透明帯）。 注：ネガティブコントロールは、同じ方法で並べて処理する必要があります。 CRISPR誘導シネフンギン耐性の割合を計算する。 薬物を含まないウェルからのプラークの平均数（X）を求め、寄生虫の生存率をX / 200として計算する。シネファンギンを含むウェルからのプラークの平均数（Y）を得て、以下のようにCRISPR誘導シネフンギン耐性の割合を計算する： CRISPR誘導抵抗率= 200×Y /（5000×X×トランスフェクション効率） 注：トランスフェクション効率は4.3.2から得られます。 CRISPR / Cas9によって誘発されたindel突然変異を調べる 37℃で2日間、HFF細胞を播種したT25フラスコ中で、セクション4.2.9からエレクトロポレーションされた寄生虫を増殖させる。次に、培地を、0.3μMのシネフンギン（選択培地）。 耐性プールが安定するまで（ネガティブコントロール群では寄生虫の増殖がないが、実験群では強力な寄生虫の増殖によって示される）、少なくとも3継代の間、寄生虫を選択培地に保つ。 クローン株を得るために、シネフンギン耐性プールをサブクローン化する。 新しく寄生した寄生虫を集め、3μm膜濾過で精製し、D10培地150μL中のコンフルエントなHFF細胞を播種した96ウェルプレートにサブクローニングする。プレートを乱すことなく37℃で7-10日間CO 2インキュベーター内でサブクローニング培養物を増殖させる。 注記： 補足ファイル1のプロトコル4.4.2.1を参照してください。 倒立位相差顕微鏡下で96ウェルプレートをチェックして、1つのプラークのみを含むウェルを探す。そのような井戸に印を付け、その後、ピペットを用いてHFF細胞を播種した24ウェルプレートに各ウェルから細胞を移す。 <ウェルのHFF細胞の80〜90％が溶解されると、寄生虫（約500μL）を回収し、50μLの寄生虫溶液を新しいウェルに移して株を維持する。 PCR増幅のためにゲノムDNAを抽出するために、残り（約450μL）を使用する。 SNF rクローンからのゲノムDNA単離のために、1000xgで10分間、寄生虫をペレット化する（少量のHFF細胞汚染が許容される）。沈殿した寄生虫をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回洗浄し、再びペレットにします。市販のキットを使用して、または沸騰させることにより、ペレット化細胞からゲノムDNAを単離する。寄生虫を50〜100μLのPBSで再懸濁する。 注：シーケンシングのためにSNR1遺伝子の断片を得るためにPCRを行う。以下のプライマーを使用して、SNR1遺伝子座2を増幅する：SNR1-Amp-Fw：5'CCGACCACAACAATTTTCおよびSNR1-Amp-Rv：5'GACGTGATTCACTTTTTACACACACAC。高忠実度のDNAポリメラーゼを使用してください。制御目的のためにWT遺伝子座を増幅する。 tを実行する20μLの反応容量でPCRを行い、98℃で1分間、次に98℃で10秒間、55℃で30秒間および72℃で2.5分間の30サイクル、続いて72℃で2分間の最終伸長。 注：以下のプライマーを使用してPCR産物を配列決定します。SNR1-Seq1： 、SNR1-Seq4：5 'CTC TCC CGC GGT CGA G、SNR1-Seq5：5' GCA CCG TCC GCA AGC、およびSNR1-Seq6：5 'CCG GAA GGT GAA TCG TTC TTC。 配列アライメントツールを用いて、シネフンギン耐性突然変異体からのSNR1遺伝子の配列とWT株のSNR1遺伝子の配列とを比較する。 注： SNR1遺伝子座での遺伝子相補またはトランスジェニック株構築のためのネガティブ選択の利用の詳細については、 補足ファイル2プロトコール5を参照のこと。